MybA1是調(diào)控合成花色苷重要酶UFGT的重要因子。本文以釀酒葡萄赤霞珠為試材。首先采用PCR技術(shù)獲得MybA1基因全長(zhǎng)序列,構(gòu)建克隆載體和表達(dá)載體獲得重組質(zhì)粒pET-mybA1, IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后經(jīng)Ni-NTA親和純化得到高純度重組蛋白,并以此為抗原免疫新西蘭大白兔,獲得了高效價(jià)、高特異性的MYBA1多克隆抗體。其次,采用western blot分析MYBA1蛋白在赤霞珠果實(shí)花后各時(shí)期以及各組織部位的表達(dá)規(guī)律,熒光定量技術(shù)分析VvmybA1基因在赤霞珠果實(shí)花后各時(shí)期以及各組織部位的瞬時(shí)表達(dá)規(guī)律,并將MybA1與LAR1、LAR2、DFR、ANS、ANR和UFGT的表達(dá)以及各基因與花色苷積累進(jìn)行了相關(guān)性分析,得到的結(jié)果如下：(1)克隆獲得了751bp、具有完整編碼框的MybA1基因片段,其編碼的一個(gè)由250個(gè)氨基酸組成、分子量約為28kDa的多肽。成功構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET-mybA1。(2)通過對(duì)MybA1的基因進(jìn)行生物學(xué)分析得出：MYBA1蛋白為親水性,定位于膜外,屬于SANT超基因家族；二級(jí)結(jié)構(gòu)由α螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲、少部分延伸鏈以及很少的β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)構(gòu)成;三級(jí)結(jié)構(gòu)顯示該蛋白為典型的R2R3-MYB蛋白；在所有含MybAl基因的幾種物種中只有變?nèi)~葡萄與葡萄的同源性較高,其它非葡萄科物種與葡萄的同源性均較低。(3) IPTG農(nóng)度為0.6mmol/L、37℃條件下誘導(dǎo)5h的條件下獲得高表達(dá)的重組蛋白,經(jīng)Ni-NTA親和純化獲得高純度的MYBA1融合表達(dá)蛋白。以His-mybA1為抗原成功獲得具有高效價(jià)(1：512,000)和良好特異性的MYBA1葡萄多克隆抗體。(4)葡萄果實(shí)花色苷含量的變化趨勢(shì)為先增加后呈平緩趨勢(shì),即在花后轉(zhuǎn)色期之前幾乎沒有積累,在花后轉(zhuǎn)色期開始含量劇增且于花后80天達(dá)到最高值,之后趨于穩(wěn)定。(5)通過對(duì)MybAl進(jìn)行基因表達(dá)分析得出：在葡萄各組織中,MybAl在果實(shí)中大量表達(dá)。果實(shí)的花后各時(shí)期MybAl的表達(dá)規(guī)律為在轉(zhuǎn)色前期幾乎不表達(dá),進(jìn)入轉(zhuǎn)色期后表達(dá)量劇增,并在轉(zhuǎn)色成熟期即花后80天達(dá)到最大值;對(duì)MYBA1進(jìn)行Western-blot分析得出：在葡萄各組織中,MYBA1在葉片中的表達(dá)量最高,果實(shí)中的表達(dá)量最小,卷須、根、莖和芽的表達(dá)量介于兩者之間且相差不大。果實(shí)的花后各時(shí)期MYBA1的表達(dá)規(guī)律為在轉(zhuǎn)色前期幾乎不表達(dá),進(jìn)入轉(zhuǎn)色期后表達(dá)量劇增,并在轉(zhuǎn)色成熟期即花后70天達(dá)到最大值。(6)相關(guān)性分析結(jié)果顯示：MybA1mRNA含量與MYBA1蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)。MYBA1蛋白的表達(dá)量與ANSmRNA、DFRmRNA的含量呈正相關(guān),與UFGTmRNA的含量呈顯著正相關(guān);MybA1mRNA含量與DFRmRNA、UFGTmRNA的含量呈顯著正相關(guān),與ANSmRNA的含量呈極顯著正相關(guān)。花色苷含量的積累與MYBA1蛋白表達(dá)呈正相關(guān);與ANSmRNA的含量呈正相關(guān),其中與MybA1mRNA、UFGTmRNA、DFRmRNA的含量呈顯著正相關(guān)。


本文編號(hào)：2273018