【摘要】：目的:乳腺癌是女性最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率位居中西方女性罹患癌癥之首,也使該病成為醫(yī)學(xué)界的一項(xiàng)難題。隨著女性對(duì)乳腺健康的重視度逐漸提高,對(duì)于乳腺癌的早診早治也是攻克乳腺癌迫切需要解決的問(wèn)題。傳統(tǒng)的診斷指標(biāo)普遍敏感性和特異性低,另外還有超聲、鉬靶、MRI等,均不能同時(shí)保證無(wú)創(chuàng)、易取且穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。miRNA是一種廣泛存在于真核生物體內(nèi)的短小非編碼RNA,長(zhǎng)度約21-23nt,可以通過(guò)與m RNA序列互補(bǔ)阻遏蛋白翻譯,從而調(diào)控蛋白表達(dá)進(jìn)而影響生物學(xué)功能。由于具有穩(wěn)定不易降解、易獲取等優(yōu)點(diǎn),血清mi RNA表達(dá)譜作為生物標(biāo)志物用于多種腫瘤及重大疾病的診斷也成為了近年來(lái)分子診斷的熱門研究之一。本文利用乳腺癌患者血清,針對(duì)不同分組間血清mi RNA的差異表達(dá),分析了血清mi RNA作為分子標(biāo)志物在臨床診斷上的應(yīng)用以及mi R-455-3p靶向PIK3CA基因在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中的作用。方法:我們共收集了92個(gè)乳腺癌患者,100個(gè)乳腺纖維腺瘤和100個(gè)健康人,又進(jìn)一步將乳腺癌樣本按照淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)移組、原位癌和浸潤(rùn)癌兩種方法進(jìn)行分組后進(jìn)行混合,接著對(duì)各組樣本進(jìn)行Affymetrix mi RNA芯片篩選,再將每組結(jié)果一一進(jìn)行合并選出差異表達(dá)的mi RNA,再用熒光定量PCR(q RT-PCR)按初篩和復(fù)篩兩步驗(yàn)證芯片結(jié)果。接著我們通過(guò)Target Scan和mir BD等網(wǎng)站上進(jìn)行mi R-455-3p靶基因的預(yù)測(cè)分析,發(fā)現(xiàn)mi R-455-3p可以靶向PIK3CA的3’UTR,遂利用收集的乳腺癌標(biāo)本提取蛋白和總RNA,通過(guò)WB、Real-time PCR和雙熒光素酶報(bào)告等實(shí)驗(yàn)檢測(cè)mi R-455-3p與PIK3CA表達(dá)水平的相關(guān)性以及在PI3K/Akt/m TOR通路的作用。結(jié)果:通過(guò)Affymetrix mi RNA芯片篩選出11個(gè)mi RNA作為候選分子,經(jīng)過(guò)初篩和復(fù)篩過(guò)程,由于mi R-455-3p在原位癌和淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)移組樣本中高表達(dá),而mi R-1825和mi R-1915-3p在浸潤(rùn)癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組樣本中高表達(dá),結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中mi R-455-3p的特異度和靈敏度最好,被認(rèn)為是乳腺癌早診的血清標(biāo)志物,而mi R-1825和mi R-1915-3p作為轉(zhuǎn)移的血清標(biāo)志物。我們進(jìn)一步檢測(cè)mi R-455-3p的功能發(fā)現(xiàn),mi R-455-3p可以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移,并具有促凋亡的趨勢(shì)。通過(guò)網(wǎng)站預(yù)測(cè)我們發(fā)現(xiàn),mi R-455-3p可以靶向PIK3CA的3’UTR,相關(guān)性較好,通過(guò)WB、Real-time PCR和雙熒光素酶報(bào)告等實(shí)驗(yàn)印證了mi R-455-3p可抑制PIK3CA減少腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力,下調(diào)Akt的表達(dá)。結(jié)論:綜上所述,我們的研究表明,mi R-455-3p可作為乳腺癌早診的血清標(biāo)志物,而mi R-1825和mi R-1915-3p可作為轉(zhuǎn)移的血清標(biāo)志物。此外,mi R-455-3p通過(guò)靶向PIK3CA基因,抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲等功能,在乳腺癌中發(fā)揮抑癌作用。另外,mi R-455-3p雖然在乳腺癌中表達(dá)比健康人低,但在原位癌中表達(dá)比浸潤(rùn)癌較高,因?yàn)樵话┚哂幸欢ǖ膼鹤兟?所以當(dāng)mi R-455-3p用于健康人篩查出現(xiàn)降低時(shí),需要結(jié)合MRI等其他手段,動(dòng)態(tài)觀察病情變化。目的:隨著社會(huì)的發(fā)展以及人類生活習(xí)慣的改變,乳腺癌的發(fā)生率也呈現(xiàn)了逐年增加的趨勢(shì),目前已成為中西方女性發(fā)病率位居第一位的惡性腫瘤。除手術(shù)之外,化療也是乳腺癌的治療方式的重要一環(huán),其中乳腺癌常用的蒽環(huán)類藥物主要是通過(guò)DNA損傷,造成腫瘤細(xì)胞的DNA信息無(wú)法繼續(xù)傳遞而死亡。隨著早期診療技術(shù)的不斷提高,乳腺癌患者的預(yù)后已經(jīng)得到了明顯的改善,但是仍有15-20%的乳腺癌患者因?yàn)閷?duì)化療出現(xiàn)耐藥而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā),最終導(dǎo)致死亡。因此,深入揭開(kāi)乳腺癌化療耐藥的分子機(jī)制才是改善乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)鍵。轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子ZEB1可作為上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵分子,在維持腫瘤干細(xì)胞的干性,以及腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲等過(guò)程中都發(fā)揮了重要的作用。但在化療耐藥方面,ZEB1的作用尚不明確。因此本實(shí)驗(yàn)旨在利用Ch IP、WB、Real-time PCR等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了ZEB1在乳腺癌中如何參與DNA損傷和修復(fù)來(lái)造成乳腺癌化療耐藥的。方法:在本實(shí)驗(yàn)中,我們首先通過(guò)WB實(shí)驗(yàn)在不同分子分型的乳腺癌細(xì)胞系中檢測(cè)ZEB1的表達(dá)。隨后我們分別構(gòu)建了過(guò)表達(dá)以及沉默ZEB1的兩株細(xì)胞系并加入化療藥物刺激,通過(guò)細(xì)胞免疫熒光等方法檢測(cè)了DNA損傷標(biāo)志物γH2AX的表達(dá)。接著,我們又在大量臨床標(biāo)本中用免疫組化的方法檢測(cè)了ZEB1、抗細(xì)胞凋亡因子Bcl-xl及細(xì)胞周期因子Cyclin D1的表達(dá)。最后,為了繼續(xù)探索ZEB1與下游哪些靶基因相互作用造成化療抵抗,我們通過(guò)Ch IP、蛋白印跡法以及生物信息學(xué)等方法,在測(cè)序中查找到147個(gè)基因,并通過(guò)查閱文獻(xiàn)最終篩選到9個(gè)ZEB1結(jié)合的候選基因,結(jié)果:通過(guò)實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)ZEB1的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞分子分型有關(guān),在惡性預(yù)后的Basal型細(xì)胞系MDA-MB-231和SUM-159中呈高表達(dá),而在預(yù)后較好的Luminal型細(xì)胞系MCF-7中呈低表達(dá)。隨后根據(jù)細(xì)胞免疫熒光和免疫組化的結(jié)果發(fā)現(xiàn)ZEB1在惡性乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)可能與DNA損傷有關(guān)。并且ZEB1與化療耐藥相關(guān)的因子表達(dá)呈正相關(guān),說(shuō)明ZEB1與乳腺癌化療耐藥具有潛在的相關(guān)性,化療耐藥的原因是DNA損傷。通過(guò)Ch IP、生物信息學(xué)分析和查閱文獻(xiàn),我們最終發(fā)現(xiàn)ATM既與ZEB1關(guān)系密切又與DNA損傷有關(guān),有望為化療耐藥的機(jī)理研究翻開(kāi)了新的篇章。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.9

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本文編號(hào)：2272649