【摘要】：目的:乳腺癌是女性最為常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率位居中西方女性罹患癌癥之首,也使該病成為醫(yī)學界的一項難題。隨著女性對乳腺健康的重視度逐漸提高,對于乳腺癌的早診早治也是攻克乳腺癌迫切需要解決的問題。傳統(tǒng)的診斷指標普遍敏感性和特異性低,另外還有超聲、鉬靶、MRI等,均不能同時保證無創(chuàng)、易取且穩(wěn)定的優(yōu)點。miRNA是一種廣泛存在于真核生物體內(nèi)的短小非編碼RNA,長度約21-23nt,可以通過與m RNA序列互補阻遏蛋白翻譯,從而調(diào)控蛋白表達進而影響生物學功能。由于具有穩(wěn)定不易降解、易獲取等優(yōu)點,血清mi RNA表達譜作為生物標志物用于多種腫瘤及重大疾病的診斷也成為了近年來分子診斷的熱門研究之一。本文利用乳腺癌患者血清,針對不同分組間血清mi RNA的差異表達,分析了血清mi RNA作為分子標志物在臨床診斷上的應(yīng)用以及mi R-455-3p靶向PIK3CA基因在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中的作用。方法:我們共收集了92個乳腺癌患者,100個乳腺纖維腺瘤和100個健康人,又進一步將乳腺癌樣本按照淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組、原位癌和浸潤癌兩種方法進行分組后進行混合,接著對各組樣本進行Affymetrix mi RNA芯片篩選,再將每組結(jié)果一一進行合并選出差異表達的mi RNA,再用熒光定量PCR(q RT-PCR)按初篩和復篩兩步驗證芯片結(jié)果。接著我們通過Target Scan和mir BD等網(wǎng)站上進行mi R-455-3p靶基因的預測分析,發(fā)現(xiàn)mi R-455-3p可以靶向PIK3CA的3’UTR,遂利用收集的乳腺癌標本提取蛋白和總RNA,通過WB、Real-time PCR和雙熒光素酶報告等實驗檢測mi R-455-3p與PIK3CA表達水平的相關(guān)性以及在PI3K/Akt/m TOR通路的作用。結(jié)果:通過Affymetrix mi RNA芯片篩選出11個mi RNA作為候選分子,經(jīng)過初篩和復篩過程,由于mi R-455-3p在原位癌和淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組樣本中高表達,而mi R-1825和mi R-1915-3p在浸潤癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組樣本中高表達,結(jié)果具有統(tǒng)計學意義。其中mi R-455-3p的特異度和靈敏度最好,被認為是乳腺癌早診的血清標志物,而mi R-1825和mi R-1915-3p作為轉(zhuǎn)移的血清標志物。我們進一步檢測mi R-455-3p的功能發(fā)現(xiàn),mi R-455-3p可以抑制乳腺癌細胞的增殖和遷移,并具有促凋亡的趨勢。通過網(wǎng)站預測我們發(fā)現(xiàn),mi R-455-3p可以靶向PIK3CA的3’UTR,相關(guān)性較好,通過WB、Real-time PCR和雙熒光素酶報告等實驗印證了mi R-455-3p可抑制PIK3CA減少腫瘤細胞的增殖和遷移能力,下調(diào)Akt的表達。結(jié)論:綜上所述,我們的研究表明,mi R-455-3p可作為乳腺癌早診的血清標志物,而mi R-1825和mi R-1915-3p可作為轉(zhuǎn)移的血清標志物。此外,mi R-455-3p通過靶向PIK3CA基因,抑制乳腺癌細胞的增殖、侵襲等功能,在乳腺癌中發(fā)揮抑癌作用。另外,mi R-455-3p雖然在乳腺癌中表達比健康人低,但在原位癌中表達比浸潤癌較高,因為原位癌具有一定的惡變率,所以當mi R-455-3p用于健康人篩查出現(xiàn)降低時,需要結(jié)合MRI等其他手段,動態(tài)觀察病情變化。目的:隨著社會的發(fā)展以及人類生活習慣的改變,乳腺癌的發(fā)生率也呈現(xiàn)了逐年增加的趨勢,目前已成為中西方女性發(fā)病率位居第一位的惡性腫瘤。除手術(shù)之外,化療也是乳腺癌的治療方式的重要一環(huán),其中乳腺癌常用的蒽環(huán)類藥物主要是通過DNA損傷,造成腫瘤細胞的DNA信息無法繼續(xù)傳遞而死亡。隨著早期診療技術(shù)的不斷提高,乳腺癌患者的預后已經(jīng)得到了明顯的改善,但是仍有15-20%的乳腺癌患者因為對化療出現(xiàn)耐藥而發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移或復發(fā),最終導致死亡。因此,深入揭開乳腺癌化療耐藥的分子機制才是改善乳腺癌患者預后的關(guān)鍵。轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子ZEB1可作為上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵分子,在維持腫瘤干細胞的干性,以及腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲等過程中都發(fā)揮了重要的作用。但在化療耐藥方面,ZEB1的作用尚不明確。因此本實驗旨在利用Ch IP、WB、Real-time PCR等實驗驗證了ZEB1在乳腺癌中如何參與DNA損傷和修復來造成乳腺癌化療耐藥的。方法:在本實驗中,我們首先通過WB實驗在不同分子分型的乳腺癌細胞系中檢測ZEB1的表達。隨后我們分別構(gòu)建了過表達以及沉默ZEB1的兩株細胞系并加入化療藥物刺激,通過細胞免疫熒光等方法檢測了DNA損傷標志物γH2AX的表達。接著,我們又在大量臨床標本中用免疫組化的方法檢測了ZEB1、抗細胞凋亡因子Bcl-xl及細胞周期因子Cyclin D1的表達。最后,為了繼續(xù)探索ZEB1與下游哪些靶基因相互作用造成化療抵抗,我們通過Ch IP、蛋白印跡法以及生物信息學等方法,在測序中查找到147個基因,并通過查閱文獻最終篩選到9個ZEB1結(jié)合的候選基因,結(jié)果:通過實驗我們發(fā)現(xiàn)ZEB1的表達與腫瘤細胞分子分型有關(guān),在惡性預后的Basal型細胞系MDA-MB-231和SUM-159中呈高表達,而在預后較好的Luminal型細胞系MCF-7中呈低表達。隨后根據(jù)細胞免疫熒光和免疫組化的結(jié)果發(fā)現(xiàn)ZEB1在惡性乳腺癌細胞中高表達可能與DNA損傷有關(guān)。并且ZEB1與化療耐藥相關(guān)的因子表達呈正相關(guān),說明ZEB1與乳腺癌化療耐藥具有潛在的相關(guān)性,化療耐藥的原因是DNA損傷。通過Ch IP、生物信息學分析和查閱文獻,我們最終發(fā)現(xiàn)ATM既與ZEB1關(guān)系密切又與DNA損傷有關(guān),有望為化療耐藥的機理研究翻開了新的篇章。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9

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本文編號：2272649