發(fā)布時(shí)間：2018-10-14 18:21

【摘要】：松嫩鹽單胞菌(Halomonas songnenensis)NEAU-ST10-39~T是一株可在15%的Na Cl及pH 10.0的堿性環(huán)境下生長(zhǎng)的中度嗜鹽菌(Moderately halophile)。本研究首先以構(gòu)建基因文庫(kù)的方法為基礎(chǔ)結(jié)合基因功能互補(bǔ)法,利用大腸桿菌(Escherichia coli)Na~+/H~+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因缺陷型株KNabc(Δnha A,Δnha B,Δcha A),從松嫩鹽單胞菌(H.songnenensis)NEAU-ST10-39~T中篩選到1個(gè)Group 1 mrp操縱子,它是一個(gè)編碼多亞基單價(jià)陽(yáng)離子/氫逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(multisubunit monovalent cation/proton antiporter),并將其定名為Hs_mrp,其編碼蛋白命名為Hs_Mrp。Hs_mrp操縱子全長(zhǎng)6 Kb,包含6個(gè)完整的開放式閱讀框和一個(gè)截短的ORF融合進(jìn)Lac Z的閱讀框(與同源蛋白只缺少1個(gè)氨基酸)(ORF7-13),并且它們擁有一個(gè)共同的啟動(dòng)子。通過蛋白同源比對(duì)發(fā)現(xiàn),Hs_Mrp與湛江鹽單胞菌(H.zhanjiangensis)中推測(cè)的單價(jià)陽(yáng)離子/氫逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Hzj_Mrp的七個(gè)亞基具有最高同源性(88.7%-98.9%)。與已鑒定的Group 1 Mrp比對(duì),發(fā)現(xiàn)除了與來(lái)自H.zhaodongensis的Hz_Mrp同源性較高(83.5-97%)以外,與其他已鑒定的Mrp對(duì)應(yīng)亞基均表現(xiàn)出較低同源性(最高為48.1%,最低28.9%)。同時(shí),基于比對(duì)結(jié)果構(gòu)建其系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹,結(jié)果顯示Hs_Mrp與一個(gè)已鑒定的和幾個(gè)推測(cè)的Group 1型Mrp聚在一起且形成一個(gè)獨(dú)立分支,這說明Hs_mrp的確編碼一個(gè)Group 1型Mrp系統(tǒng)。為了深入地揭示Hs_mrp的耐鹽堿機(jī)制,我們分別在異源宿主大腸桿菌(E.coli)KNabc和在同源宿主NEAU-ST10-39~T Hs_mrp基因敲除突變菌株中進(jìn)行了相關(guān)功能鑒定實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如下:(1)在異源宿主中,耐鹽堿測(cè)定顯示:Hs_mrp可使(E.coli)KNabc在0.8 M Na Cl、一定濃度Li Cl(5 m M)及p H 8.0的堿性環(huán)境中恢復(fù)生長(zhǎng);陽(yáng)離子/H~+逆向蛋白活性測(cè)定顯示,KNabc/p UC-mrp制備的反轉(zhuǎn)膜在p H 7.5-9.5的范圍內(nèi)表現(xiàn)出了較高的Na~+(Li~+,K~+)/H~+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)活性,且在p H 9.5下活性最高,表觀K0.5值分析顯示,Na~+、Li~+和K~+的K0.5值分別是0.64、1.05和0.76。結(jié)果說明Hs_Mrp是pH依賴性的Na~+(Li~+,K~+)/H~+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白且即Na~+是最適底物,其次是K~+和Li~+。(2)首先成功構(gòu)建了基因敲除質(zhì)粒pK18-mrp-Nco I和攜帶慶大霉素抗性的pK18-mrpGm;其次,敲除質(zhì)粒p K18-mrp-Nco I通過電轉(zhuǎn)化方法順利進(jìn)入NEAU-ST10-39~T;然后利用反向篩選成功地獲得了兩株Hs_mrp基因敲除菌株,我們將其命名為NEAU-ST10-39~T-?mrp-7和NEAU-ST10-39~T-?mrp-23;最后,我們成功將攜帶有完整Hs_mrp操縱子的重組穿梭質(zhì)粒p MCS5-mrp轉(zhuǎn)入到敲除突變株中,將其互補(bǔ)突變菌株命名為NEAU-ST10-39~T-?mrp/p MCS5-mrp。(3)在同源宿主中,對(duì)Hs_mrp敲除突變株進(jìn)行了相應(yīng)生理測(cè)試。耐鹽測(cè)試結(jié)果發(fā)現(xiàn):NEAU-ST10-39~T-?mrp/pMCS5-mrp(互補(bǔ)突變株)表現(xiàn)出與野生型菌株類似的耐鹽能力,既Hs_mrp操縱子可以互補(bǔ)敲除菌株;處于pH 7的中性條件下,存在2%和3%的NaCl濃度時(shí),敲除菌株與野生型菌株和互補(bǔ)突變株的生長(zhǎng)情況沒有差異;然而,隨著鹽濃度的升高,敲除菌株的生長(zhǎng)明顯受到抑制。在pH8或pH9的堿性條件下,從2%或3%的NaCl濃度開始,敲除菌株生長(zhǎng)就已經(jīng)受到了明顯的抑制。以上表明:在中性條件下,Hs_mrp對(duì)宿主菌在高鹽下的生長(zhǎng)具有重要作用;而在堿性條件下,Hs_mrp對(duì)宿主菌在較低鹽濃度下的生長(zhǎng)就已經(jīng)起到作用。鑒于以上結(jié)果,我們認(rèn)為Hs_Mrp是一個(gè)具有Na~+(Li~+,K~+)/H~+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)活性的Group 1型Mrp系統(tǒng);并成功地構(gòu)建了NEAU-ST10-39~T的Hs_mrp基因敲除突變菌株。
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【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q78

【參考文獻(xiàn)】

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1 徐蕊;張苓花;;四氫嘧啶吸收缺陷突變株高效制備四氫嘧啶[J];微生物學(xué)報(bào);2012年05期

2 李秀軍,李取生,王志春,劉興土;松嫩平原西部鹽堿地特點(diǎn)及合理利用研究[J];農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化研究;2002年05期

3 徐德強(qiáng),黃靜娟,張紀(jì)忠,范欽,劉東來(lái);鹽單胞菌屬一新種——黃海鹽單胞菌[J];微生物學(xué)報(bào);1995年05期

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本文編號(hào)：2271252