【摘要】：目的阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是發(fā)生于老年期或者老年前期的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變,主要特征表現(xiàn)為進行性認知功能損害和行為障礙,屬于老齡人群最常見的癡呆類型,約占老年期癡呆的50%~70%。臨床一般將AD以65歲為界限,分為早發(fā)型AD(early-onset AD,EOAD)和晚發(fā)型AD(Late-onset AD,LOAD)。無論EOAD還是LOAD都被證實與遺傳密切相關(guān),其中EOAD多表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳,而LOAD的遺傳模式較為復雜,可能是遺傳、環(huán)境和代謝共同作用的結(jié)果,其中APOE基因是最為公認的LOAD易患基因,APOEε4基因攜帶者是散發(fā)性AD的高危人群。細胞生物學以及流行病學研究發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)代謝改變在LOAD患者中普遍存在,但目前缺乏對于脂質(zhì)代謝與LOAD相關(guān)性的基因調(diào)控方面的研究。研究業(yè)已證實APOE基因突變僅與不到50%的易感個體發(fā)病相關(guān),提示AD其他的遺傳學危險因素未被發(fā)現(xiàn)。表觀遺傳學信息主要負責執(zhí)行DNA遺傳信息的指令的時機和方式,包括DNA甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA比如miRNA的調(diào)控3個方面。遺傳和表觀遺傳改變可能影響腦組織miRNA表達,失調(diào)的Micro RNAs(miRNAs)與β淀粉樣蛋白(β-amyloid,Aβ)的產(chǎn)生、Tau蛋白的病理性沉積、突觸可塑性、炎性反應(yīng)等有關(guān)。同時表觀遺傳學的信息改變是可以逆轉(zhuǎn)的,從而為治療提供了新的途徑。miRNAs發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后下調(diào)作用,它們對靶基因的3’非編碼區(qū)(UTR)的靶序列可能因單核苷酸基因多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)而改變。miRNAs參與脂質(zhì)相關(guān)基因的表達調(diào)控,包括凝聚素基因(Clusterin gene,CLU)、脂蛋白脂酶基因(Lipoprotein lipase gene,LPL)以及低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6基因(LDL receptor related protein6 gene,LRP6)。這些基因的miRNAs結(jié)合區(qū)域的基因多態(tài)性可能通過miRNAs調(diào)控的途徑介導AD的發(fā)病。CLU又稱載脂蛋白J(apolipoprotein J,Apo J),是AD的第3風險基因,位于染色體8p21-p12區(qū)域,即AD的興趣區(qū)域,參與LOAD 9%的發(fā)病風險。LPL屬于甘油三酯(triglyceride,TG)代謝的關(guān)鍵酶,LPL基因位于人類染色體8p22,LPL基因的SNPs與AD的病理過程顯著相關(guān),LPL可與APOE及其受體LRP相互作用,而APOE和LRP都有增加AD風險的基因多態(tài)性。LPL可以與AD相關(guān)蛋白Aβ直接相互作用,從而促進星形膠質(zhì)細胞通過葡糖胺葡聚糖依賴的Aβ的內(nèi)吞。LPL正常功能受到影響后,可能會導致Aβ清除障礙,最終加劇AD的發(fā)生和進展。LRP和淀粉樣前體蛋白、配體APOE等共存于AD的病理特征之一即老年斑中,并調(diào)節(jié)著淀粉樣前體蛋白和載脂蛋白E的代謝。人類LRP6基因定位于染色體12p11.2-p13.3,之前的研究提示,LRP6δ3 m RNA在AD腦中與對照組相比水平明顯擴增,所以LRP6的SNPs基因多態(tài)性與AD相關(guān)。為此根據(jù)Target Scan、miR-base數(shù)據(jù)庫篩選,我們探討如下6個基因的miRNA結(jié)合位點與LOAD發(fā)病風險的關(guān)聯(lián)性,包括:CLU(miRNA-382結(jié)合位點rs9331949)、LPL(miRNA-424/-146b-5p/-15a/16/497結(jié)合位點rs1059507;miRNA-135a/-96/-514結(jié)合位點rs3200218;miRNA-143/-511/-140-5p結(jié)合位點rs3208305;miRNA-210結(jié)合位點rs3735964)以及LRP6(miRNA-601結(jié)合位點rs2160525)6個基因的3’UTR SNPs。我們通過基因表達調(diào)控層面尋找AD的易患基因,期待為AD的診治提供新的理論依據(jù)。方法采用病例對照研究,從2011年1月到2015年12月,本課題組連續(xù)在青島市立醫(yī)院,青島大學附屬醫(yī)院,青島市海慈醫(yī)院和市內(nèi)四區(qū)的其它醫(yī)院,以及周邊的幾所市級醫(yī)院收集AD病例,同期在上述醫(yī)院的健康查體中心收集健康對照,包括2338例獨立觀察對象:其中LOAD患者984例,健康對照1354例。所有納入對象均出生于山東省,常年居住于山東地區(qū)。所有納入病例和對照的研究對象的年齡均大于65歲且互相之間無血緣關(guān)系。病例組和對照組年齡、性別均匹配。所有入選病例均獲得了其本人或其監(jiān)護人的知情同意。研究對象或其監(jiān)護人均簽署知情同意書,而且本研究由青島市市立醫(yī)院倫理委員會通過。所有研究對象根據(jù)1984年美國國立神經(jīng)病語言障礙卒中研究所和阿爾茨海默病及相關(guān)疾病學會(National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke and the Alzheimer’s disease and Related Disorders Association,NINCDS-ADRDA)對于“很可能的AD”的定義對患者進行診斷,其中我們對受試者進行簡易的精神狀態(tài)量表和日常行為功能量表測試;健康對照組認知功能及日常生活能力正常,自身與以往相比無明顯下降且與常人無明顯差別;所有研究對象年齡大于65歲,并且排除有嚴重影響神經(jīng)系統(tǒng)功能的內(nèi)科疾病患者。采集清晨空腹時肘正中靜脈血,采用Wizard染色體DNA提純試劑盒通過靜脈全血提取染色體DNA。我們進行了rs9331949、rs1059507、rs3200218、rs3208305、rs3735964以及rs2160525位點的3’UTR SNPs及APOE基因分型檢測。rs3208305,rs2160525,rs1059507和rs9331949位點的SNP基因型檢測原理是雙連接和多重熒光聚合酶鏈反應(yīng)。rs3735964和rs3200218多態(tài)性檢測原理是聚合酶鏈反應(yīng)-連接酶檢測反應(yīng)。APOE基因型的檢測根據(jù)Donohoe等所敘述的方法,我們通過對其擴增產(chǎn)物長度的判斷,把Apo E三種常見的等位基因ε2,ε3,ε4攜帶情況分為E2/2,E2/3,E2/4,E3/3,E3/4及E4/4等6種基因型。計算病例組和對照組基因型的Hardy-Weinberg平衡(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE)擬合優(yōu)度。AD病例組和對照組分為APOEε4陽性和陰性亞組,采用χ2檢驗計算其基因型和等位基因分布差異,包括P值,比值比(Odds Ratio,ORs),95%置信區(qū)間(confidence intervals,CIs)。校正性別、APOEε4情況和發(fā)病年齡或檢查年齡后,通過多變量Logistic回歸分析計算OR值和95%CIs,以評估如下3個模型的基因型和等位基因與AD的關(guān)聯(lián)性,賦值情況:顯性模型為1(aa+Aa)和0(AA),隱性模型為1(aa)和0(Aa+AA),疊加模型為0(AA)和1(Aa)和2(aa)(A代表主要等位基因,a代表次要最小等位基因)。針對基因優(yōu)化模型的SNP-APOE的交互作用進行了計算。數(shù)據(jù)分析采用SPSS19.0分析軟件,P0.05認為有統(tǒng)計學意義。最后進行連鎖不平衡和單體型分析,驗證LPL的4個位點是否與LOAD風險有關(guān)聯(lián)。結(jié)果納入的研究對象中,LOAD患者984例,年齡和性別相匹配的健康對照者1354例,年齡(P=0.186)和性別(P=0.068)在病例組和對照組差別無統(tǒng)計學意義(LOAD組的發(fā)病年齡與對照組的檢查時年齡相比較)。病例組的MMSE評分顯著低于對照組(P0.001)。APOEε4等位基因情況在LOAD組和對照組中差別有顯著統(tǒng)計學意義(P0.001);APOEε4基因在亞組中增加2.44倍LOAD患病風險(OR=2.44;95%CI::1.98~3.00;P0.001)。HWE檢驗證實,除rs3208305以外,研究中的檢測SNPs符合H-W平衡。重新檢查基因分型未發(fā)現(xiàn)錯誤,推測這種不平衡可能是由于樣本規(guī)模、人群地域分配、隨機遺傳漂變等其他不確定的因素造成的�；趯φ战M所檢測到的最小等位基因頻率,我們研究的樣本量在0.05的差異性水平上具有超過80%的統(tǒng)計學功效來檢測比值比(odds ratio,OR),這提示本研究對象具有很好的中國漢族人群的代表性。在總體的樣本中,我們僅觀察到rs9331949(P0.001,Pc=0.001)和rs3735964(P=0.006,Pc=0.036)在病例組和對照組的基因分布中差異有顯著性。在調(diào)整了年齡、性別和APOEε4等位基因情況后,rs9331949與LOAD的相關(guān)性仍然存在。與此同時,rs9331949等位基因C的出現(xiàn)增加1.3倍的AD患病風險(P0.001,OR=1.30,95%CI=1.14~1.50)。根據(jù)APOEε4情況進行攜帶者和非攜帶者的分組,在總樣本中,我們發(fā)現(xiàn)rs3200218和APOEε4的交互作用。對于rs9331949,基因型和等位基因頻率在LOAD組和對照組中APOEε4攜帶者和非攜帶者中存在顯著性差異,最小等位基因(等位基因C)者顯著增加了LOAD風險。進行Bonferroni調(diào)整后,基因型和等位基因頻率僅在APOEε4非攜帶者中有顯著性差異。對于rs3200218,APOEε4攜帶者中,LOAD組和對照組有顯著性差異,最小等位基因(等位基因G)明顯增加了LOAD風險。然而,這種顯著性的差異在Bonferroni調(diào)整后消失;其他四種SNPs的基因型和等位基因頻率與AD的患病風險無明顯相關(guān)。進行了多元Logistic回歸分析以評估6種SNPs在總樣本、APOEε4攜帶者和非攜帶者LOAD的作用(在總體樣本中調(diào)整性別、發(fā)病或檢查年齡和APOEε4攜帶情況,對APOEε4攜帶者和非攜帶者僅做性別和年齡的調(diào)整)。對于rs9331949,進行Bonferroni調(diào)整后,疊加模型和隱性模型顯示與LOAD相關(guān)。但在APOEε4非攜帶者中,僅有隱性模型在Bonferroni調(diào)整后顯示與LOAD相關(guān)(OR=2.09,95%CI=1.45~3.02,Pc=0.02).其他5個SNPs在Bonferroni調(diào)整后,在上述三個遺傳學模型中在總樣本、APOEε4攜帶者和非攜帶者與LOAD風險關(guān)系不明確。連鎖不平衡和單體型分析提示,4種SNPs(rs1059507,rs3200218,rs3208305和rs3735964)在所有3個數(shù)據(jù)集中形成1個單體型(總樣本:D’=1.0,r2=0.01)。3種SNPs(rs1059507,rs3208305和rs3735964)在APOEε4攜帶者中形成1個單體型(APOEε4等位基因攜帶者:D’=1.0,r2=0.011)。4種SNPs(rs1059507,rs3200218,rs3208305和rs3735964)在APOEε4非攜帶者中形成1個單體型(APOEε4等位基因非攜帶者:D’=1.0,r2=0.376)。進一步,在總樣本、APOEε4非攜帶者中,我們發(fā)現(xiàn)4個SNPs形成4個單體型(TCCA,TCCG,ATCA,ACAA),但是他們在任何數(shù)據(jù)集中與LOAD風險都無明顯相關(guān)(P0.05)。此外,3個單體型(TCC,ATC,ACA)在APOEε4攜帶者中有3種SNPs形成(P0.05)。連鎖不平衡和單體型分析提示LPL4個位點與LOAD風險無明顯相關(guān)。結(jié)論:1、APOEε4基因攜帶者能夠增加2.44倍LOAD患病風險。2、CLU 3’UTR miRNA結(jié)合區(qū)的rs9331949位點基因多態(tài)性與LOAD相關(guān),rs9331949等位基因C的出現(xiàn)增加1.3倍的AD患病風險。3、在APOEε4等位基因非攜帶者亞組中,rs9331949基因多態(tài)性仍與LOAD顯著相關(guān)。4、LPL(rs1059507、rs3200218、rs3208305、rs3735964)以及LRP6(rs2160525)3’UTR miRNA結(jié)合區(qū)基因多態(tài)性未發(fā)現(xiàn)與LOAD相關(guān)。我們的研究為揭示脂質(zhì)代謝相關(guān)基因?qū)е掳柎暮Ｄ〉陌l(fā)病機制和生物標志物提供初步理論證據(jù);為表觀遺傳學在AD的診治研究構(gòu)建理論基礎(chǔ)。該3’UTR SNPs針對LOAD發(fā)病風險的作用機制有待于未來更多的研究,同時也為全面了解AD的發(fā)病和進展以及AD的治療提供了更多途徑。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：青島大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R749.16

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本文編號：2271050