【摘要】：人與小鼠腦組織轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)與功能比較研究背景：伴隨人口老齡化趨勢(shì)日益加劇,神經(jīng)退行性疾病已成為影響人類(lèi)生命健康及生活質(zhì)量的主要疾病負(fù)擔(dān)。截止目前,這類(lèi)疾病的病因及發(fā)病機(jī)制仍不清楚,在臨床上也尚無(wú)控制病程進(jìn)展的有效措施。建立理想的動(dòng)物模型對(duì)于探索這類(lèi)疾病的發(fā)病機(jī)制及藥物篩選十分重要。小鼠因?yàn)槠潴w積小,妊娠期短,飼養(yǎng)成本低,基因工程技術(shù)相對(duì)成熟,大腦解剖結(jié)構(gòu)和生理功能與人類(lèi)較為接近而成為用于模擬人類(lèi)神經(jīng)退行性疾病較為理想的模式動(dòng)物。構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠的首要問(wèn)題是要考慮某個(gè)感興趣基因的表達(dá)及功能在健康人與小鼠之間是否一致。因此,弄清健康人與小鼠大腦轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)與功能的相似性及差異性,不僅能為建立神經(jīng)退行性疾病小鼠模型并評(píng)價(jià)其有效性和準(zhǔn)確性提供參考,也有助于從轉(zhuǎn)錄組水平上解釋人與小鼠學(xué)習(xí)記憶與認(rèn)知能力差異的潛在原因。方法：健康成年人與小鼠前額葉皮層(prefrontal cortex, PFC)、海馬(hippocampus,HIP)及紋狀體(striatum, STR)的基因(mRNA)表達(dá)譜數(shù)據(jù)來(lái)源于GEO數(shù)據(jù)庫(kù)。利用Expression Console軟件預(yù)處理原始數(shù)據(jù),RMA算法標(biāo)準(zhǔn)化探針。利用百分位數(shù)法挖掘相對(duì)高表達(dá)基因并通過(guò)DAVID軟件進(jìn)行功能富集分析。Venn分析用于描述不同生物學(xué)過(guò)程(Biological process, BP)節(jié)點(diǎn)集的重疊率；R包GOSemSim的mgoSim函數(shù)用于GO語(yǔ)義相似性分析。對(duì)同源基因的熒光信號(hào)校正后利用1-皮爾森相關(guān)系數(shù)計(jì)算表達(dá)距離,分層聚類(lèi)和主成分分析用于表達(dá)模式評(píng)估。物種特異表達(dá)的同源基因通過(guò)比較極端數(shù)據(jù)集的方法挖掘并利用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。Limma算法及百分位倍數(shù)變化用于分析差異表達(dá)的同源基因,String數(shù)據(jù)庫(kù)用于挖掘差異表達(dá)同源基因之間的互作關(guān)系,Cytoscape軟件對(duì)網(wǎng)絡(luò)可視化。分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩圆⒗肕CODE算法挖掘高連通的功能子網(wǎng)絡(luò)模塊,DAVID軟件用于分析網(wǎng)絡(luò)功能。利用小RNA測(cè)序技術(shù)檢測(cè)健康成年人與小鼠海馬組織miRN A的表達(dá)。原始數(shù)據(jù)預(yù)處理后,鑒定已知成熟的miRNA、其它小RNA及新發(fā)現(xiàn)的miRNA。新miRNA的靶基因通過(guò)TargetScan算法預(yù)測(cè),DAVID軟件用于靶基因功能注釋。成熟miRNA的表達(dá)水平通過(guò)TPM(transcripts per million)標(biāo)準(zhǔn)化,利用DIANA-mirPath v3.0軟件分析人與小鼠海馬富集或特異表達(dá)的miRNA功能。Spearman相關(guān)系數(shù)用于分析兩物種海馬miRNA的表達(dá)模式。相對(duì)小鼠,人海馬顯著差異表達(dá)的miRNA通過(guò)edgeR算法和倍數(shù)變化鑒定。miRanda、Pictar、DIANA-microT以及Targetscan算法用來(lái)預(yù)測(cè)差異miRNA的靶基因,根據(jù)反向調(diào)節(jié)的原則進(jìn)一步篩選miRNA-mRNA互作關(guān)系對(duì)。利用Cytoscape軟件可視化相對(duì)小鼠的人海馬差異miRNA-mRNA功能調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果：人與小鼠對(duì)應(yīng)腦組織高表達(dá)基因顯著富集的主要BP節(jié)點(diǎn)高度一致；顯著富集的KEGG通路及其顯著性相似；PFC、HIP及STR中同源基因的表達(dá)模式在人與小鼠間高度保守。人腦組織高表達(dá)基因顯著富集的BP節(jié)點(diǎn)約為小鼠對(duì)應(yīng)腦組織的兩倍：與神經(jīng)活動(dòng)相關(guān)的BP節(jié)點(diǎn)也顯著多于小鼠,其中神經(jīng)元投射的生成與發(fā)育為人類(lèi)特有；腦組織高表達(dá)基因功能富集結(jié)果中相同BP節(jié)點(diǎn)的顯著性具有物種特異性；兩物種對(duì)應(yīng)腦組織高表達(dá)基因顯著富集的BP節(jié)點(diǎn)重疊率及語(yǔ)義相似性具有明顯的物種特異性；COX5B, WIF1, SLC4A10和PLA2G7為鑒定的物種特異表達(dá)的同源基因；相對(duì)小鼠腦組織,人對(duì)應(yīng)腦組織差異表達(dá)的同源基因功能調(diào)控網(wǎng)絡(luò)具有無(wú)尺度和小世界屬性,存在與神經(jīng)活動(dòng)顯著相關(guān)的子網(wǎng)絡(luò)功能模塊。在人海馬組織中新鑒定出一條miRNA, Novel-21-5p,其候選靶基因主要在突觸,突觸小體,囊泡,突觸后密集區(qū),投射神經(jīng)元上表達(dá),參與了神經(jīng)遞質(zhì)傳遞,神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)信號(hào)通路及膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展等。miR-9-5p在人與小鼠海馬中表達(dá)量占比最高。人海馬富集表達(dá)的前20個(gè)miRNA參與了神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子TRK受體信號(hào)通路,突觸傳遞及軸突導(dǎo)向等生物學(xué)過(guò)程。人海馬特異表達(dá)的,miR-656-3p參與了突觸傳遞,神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子TRK受體信號(hào)通路,神經(jīng)元細(xì)胞-細(xì)胞粘連等生物學(xué)過(guò)程。人與小鼠海馬同源miRNA的表達(dá)模式高度保守,表達(dá)保守性與序列保守性呈正相關(guān)。相對(duì)小鼠海馬的人海馬差異miRNA-mRNA功能調(diào)控網(wǎng)絡(luò)為二分圖,其中下調(diào)網(wǎng)絡(luò)與模式規(guī)范過(guò)程,區(qū)域化,前-后模式形成,視覺(jué)感知,光刺激的感官知覺(jué)等生物學(xué)過(guò)程相關(guān)。結(jié)論：本研究發(fā)現(xiàn)人與小鼠對(duì)應(yīng)腦組織高表達(dá)基因的主要功能相似,人與小鼠海馬富集表達(dá)的miRNA種類(lèi)相似；同源mRNA及miRNA表達(dá)模式高度保守,這可能是人與小鼠大腦解剖結(jié)構(gòu)及細(xì)胞類(lèi)型保持高度一致的遺傳基礎(chǔ),說(shuō)明在一定程度上小鼠可以準(zhǔn)確有效地用于模擬人類(lèi)神經(jīng)系統(tǒng)的生理病理過(guò)程。然而人腦組織高表達(dá)基因功能相對(duì)小鼠更加復(fù)雜多樣；人與小鼠腦組織高表達(dá)基因的生物功能趨于物種相似性；兩物種間存在差異調(diào)控的子網(wǎng)絡(luò)模塊,并與神經(jīng)生理病理過(guò)程相關(guān)；人海馬中新鑒定的、特異表達(dá)的、富集表達(dá)的rniRNA以及下調(diào)miRNA-mRNA功能調(diào)控網(wǎng)絡(luò)均參與了重要的神經(jīng)生理病理過(guò)程。這些結(jié)果可為進(jìn)一步理解人與小鼠神經(jīng)行為表型差異提供分子遺傳基礎(chǔ)。多巴胺D5受體與胃泌素受體相互作用及其促尿鈉排泄效應(yīng)研究背景：腎臟多巴胺D1樣受體(D1R和D5R)及胃泌素受體(CCKBR)在維持機(jī)體鈉平衡中扮演著重要角色。先前的研究表明D1R與CCKBR在腎近曲小管(renal proximal tubule, RPT)中協(xié)同互作,具有促尿鈉排泄的作用。相比D1R,D5R具有持續(xù)活性,對(duì)多巴胺的親和力更強(qiáng)。因此本研究旨在探索D5R與CCKBR的相互作用及其促尿鈉排泄效應(yīng)。方法:利用免疫印跡技術(shù)檢測(cè)CCKBR配體gastrin、CCKBR特異性抑制劑Y F476、 gastrin+YF476處理的人腎小管上皮細(xì)胞(human renal tubular epithelial cell line, HK-2)中D5R表達(dá)；檢測(cè)D1R/D5R特異性激動(dòng)劑fenoldopam、特異性抑制劑Sch23390、fenoldopam+Sch23390處理的HK-2細(xì)胞中CCKBR表達(dá)；并檢測(cè)gastrin促進(jìn)D5R表達(dá)以及fenoldopam促進(jìn)CCKBR表達(dá)的時(shí)間與劑量依賴(lài)效應(yīng)。利用異源表達(dá)人D5R和CCKBR的HEK293細(xì)胞(HEK293-D5R-CCKBR)及血壓正常人的RPT細(xì)胞(NT)驗(yàn)證D5R與CCKBR互作的特異性。利用免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)D5R與CCKBR在HK-2及HEK293-D5R-CCKBR細(xì)胞中的直接互作效應(yīng)；利用免疫熒光共定位技術(shù)檢測(cè)D5R與CCKBR在HK-2細(xì)胞及BALB/c、鼠RPT中的亞細(xì)胞定位。利用免疫印跡技術(shù)檢測(cè)D5R及CCKBR基因敲除(D5R-/-及CCKBR-/-)小鼠腎皮質(zhì)細(xì)胞膜CCKBR及D5R蛋白表達(dá)。高鹽喂養(yǎng)4月齡雄性BALB/c小鼠2周后分為7組,分別腹腔注射生理鹽水、Sch23390、YF476、 fenoldopam、gastri、fenoldopam+YF476及gastrin+Sch23390,每天1次,7天后收集24小時(shí)尿液并檢測(cè)鈉和肌酐濃度。結(jié)果：D5R與CCKBR在HK-2、HEK293-D5R-CCKBR及NT細(xì)胞中協(xié)同互作,具有時(shí)間與劑量依賴(lài)效應(yīng)。D5R與CCKBR在HK-2及HEK293-D5R-CCKBR細(xì)胞中共沉淀,在HK-2細(xì)胞及BALB/c小鼠RPT中共定位。CCKBR在D5R-/-小鼠腎皮質(zhì)細(xì)胞膜上的表達(dá)顯著高于D5R+/+小鼠；D5R在CCKBR-/-小鼠腎皮質(zhì)細(xì)胞膜上的表達(dá)顯著高于C CKBR+/+小鼠。高鹽飲食促進(jìn)了BALB/c小鼠腎皮質(zhì)細(xì)胞膜D5R及CCKBR蛋白表達(dá)。CCKBR-/-、鼠相比CCKBR+/+小鼠血壓升高,尿鈉排泄減少。CCKBR特異性抑制劑YF476及D1R/D5R特異性抑制劑Sch23390能夠抑制高鹽飲食誘導(dǎo)的尿鈉排泄效應(yīng)；D1R/D5R特異性抑制劑Sch23390能夠顯著減弱CCKBR配體gastrin誘導(dǎo)的促尿鈉排泄效應(yīng)；CCKBR特異性抑制劑YF476能夠顯著減弱D1R/D5R特異性激動(dòng)劑fenoldopam誘導(dǎo)的促尿鈉排泄效應(yīng)。結(jié)論：D5R與CCKBR在腎臟中協(xié)同互作,在維持高鹽飲食后機(jī)體鈉平衡過(guò)程中具有重要作用。
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【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R741
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本文編號(hào)：2270853