【摘要】：目的:卵巢癌(Ovarian Cancer,OC)是婦科常見的惡性腫瘤,在女性生殖器官惡性腫瘤中,卵巢癌的發(fā)病率占第三位,但由于早期診斷困難和化療耐藥,且易發(fā)生腹腔轉(zhuǎn)移,卵巢癌的死亡率居第一位,其五年生存率僅為30%左右,故卵巢癌又被稱為“沉默殺手”。對于卵巢癌有效的早期篩查或治療都應基于對疾病發(fā)病機制的詳細了解,而以往卵巢癌的病因?qū)W研究多集中在環(huán)境、行為、生殖等方面,隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展,近年來更多的研究體現(xiàn)在癌基因和抑癌基因方面,研究者發(fā)現(xiàn),卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展與多種基因的突變、失活、表達異常有關(guān),研究相關(guān)基因水平改變,尋找新的卵巢癌相關(guān)致病基因,對探討卵巢癌發(fā)生發(fā)展機制將起重要的作用,將為卵巢癌的早期診斷,治療手段的選擇,治療藥物的應用以及新藥研發(fā)提供積極的幫助。美國癌癥基因組圖譜計劃TCGA(The Cancer Genome Atlas)是近年來啟動的腫瘤基因組數(shù)據(jù)庫,這些大數(shù)據(jù)的出現(xiàn),為腫瘤分子靶點的發(fā)現(xiàn)提供了機遇,對于研究者全面系統(tǒng)了解惡性腫瘤的形成、生長、轉(zhuǎn)移等過程的生物學基礎(chǔ),以及與病理機制相關(guān)的基因組變化,促進癌癥的早期診斷和加速癌癥治療的發(fā)展步伐起到重要推動作用。本研究擬先通過生物信息學的方法從高通量基因組數(shù)據(jù)庫中篩選出一批與卵巢癌患者預后密切相關(guān)的基因,結(jié)合文獻檢索創(chuàng)新性確定待研究候選基因,鎖定候選基因后運用體外實驗分析以上基因?qū)δ[瘤細胞增殖、凋亡和侵襲等的影響,并進一步探討候選基因在卵巢癌中發(fā)揮作用的相關(guān)信號通路,同時評價以上基因作為診斷、預后判斷指標的可行性。方法與結(jié)果:第一部分:卵巢癌差異表達基因的篩選。采用網(wǎng)絡共享數(shù)據(jù)庫TCGA數(shù)據(jù),通過生物學信息學分析卵巢癌差異表達基因,從TCGA數(shù)據(jù)庫中下載卵巢漿液性囊腺癌的m RNA表達譜芯片數(shù)據(jù),芯片平臺是Agilent G4502A。原始數(shù)據(jù)預處理之后,總共得到17814個基因的表達數(shù)據(jù),通過R中Limma軟件包和T-test進行差異表達基因分析,兩種方法共有差異表達基因數(shù)目為2010個,分別使用DAVID對差異基因進行GO和KEGG pathway富集分析,設定p0.05作為篩選的條件,功能注釋結(jié)果顯示,卵巢癌差異表達基因富集在細胞粘附、細胞凋亡等功能以及主要參與粘著斑、癌癥相關(guān)等信號通路中。2.卵巢癌預后相關(guān)新基因的鑒定和確認。對TCGA數(shù)據(jù)庫中卵巢癌的臨床數(shù)據(jù)進行篩選,保留的樣本數(shù)量共580例。并運用單因素Cox回歸方法篩選,得出32個基因?qū)β殉舶┗颊叩念A后影響有顯著意義(p0.01)。采用隨機分組的方法把包含完整2年隨訪數(shù)據(jù)的樣本分為訓練組和驗證組,兩組的樣本數(shù)目分別為214例和212例。分別使用上述劃分的訓練集和驗證集進行生存分析,對于每一個基因,根據(jù)其表達值對樣本進行分類,并結(jié)合臨床數(shù)據(jù),使用單因素Cox回歸分析,log-rank檢驗進行預后分析并繪制KM預后曲線圖。根據(jù)生存曲線篩選結(jié)果,結(jié)合文獻查新和應用前景分析,最后選取與預后密切相關(guān)的3個基因(CD27、SPINK13和RHPN2)進行研究。其中CD27、SPINK13的低表達與較斷的患者生存率相關(guān),而RHPN2的高表達則提示患者預后不良。第二部分:1.CD27對卵巢癌細胞的抑制作用及機制研究。前期的實驗結(jié)果表明CD27的低表達與患者的較短生存期相關(guān),提示CD27具有抑癌基因樣功能。為了研究CD27的功能,我們以卵巢癌細胞系和組織樣本為研究對象,通過檢測其表達情況,以及過表達和下調(diào)CD27的方法研究其在卵巢癌中的作用。實驗先通過細胞轉(zhuǎn)染CD27過表達質(zhì)粒上調(diào)其在SKOV3和A2780細胞中的表達水平。轉(zhuǎn)染成功后,采用MTT法檢測細胞增殖活力,采用AnnexinⅤ/PI雙染法檢測細胞凋亡率。結(jié)果提示CD27可以顯著抑制卵巢癌細胞的增殖活力,同時提高細胞凋亡率。而后,我們又通過抑制CD27相關(guān)信號通路的方法來研究其功能,結(jié)果發(fā)現(xiàn)下調(diào)CD27可以促進細胞增殖同時降低細胞凋亡率。以上結(jié)果證明了CD27具有抑制增殖促進凋亡的功能。接下來對CD27可能的下游分子機制進行了初步研究,發(fā)現(xiàn)CD27能夠顯著抑制IL-6的水平,同時IL-6可以顯著促進卵巢癌細胞增殖并可以完全逆轉(zhuǎn)CD27的抑制增殖和促進凋亡的效應。這些結(jié)果提示CD27對卵巢癌的作用可能與其對IL-6的抑制有關(guān)。2.SPINK13對卵巢癌細胞的抑制作用及機制研究。本部分的實驗中,我們同樣先驗證SPINK13在上皮性卵巢癌組織樣本及細胞系中的表達情況,后分別使用過表達和下調(diào)SPINK13水平的方法對其功能進行研究。首先,我們采用SPINK13過表達真核質(zhì)粒,通過細胞轉(zhuǎn)染上調(diào)其在卵巢癌細胞系中的表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn),上調(diào)SPINK13能夠明顯抑制細胞增殖活力同時促進細胞凋亡。反之,下調(diào)SPINK13的水平能夠顯著促進細胞增殖以及降低細胞凋亡率。同時,實驗檢測了EMT相關(guān)分子標記,以及SPINK13對腫瘤細胞遷移和侵襲的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),SPINK13能夠抑制EMT過程,抑制細胞的遷移功能。而后,在對其分子機制的研究中我們又發(fā)現(xiàn),SPINK13能夠顯著抑制u PA的表達。而重組u PA可以逆轉(zhuǎn)SPINK13對細胞遷移和侵襲的抑制作用。鑒于這些實驗結(jié)果,提示SPINK13可能通過靶向u PA,進而抑制EMT的機制發(fā)揮其調(diào)控卵巢癌細胞增殖、凋亡和遷移作用。3.RHPN2對卵巢癌細胞的作用研究。在對RHPN2功能的研究中我們發(fā)現(xiàn),通過構(gòu)建的RHPN2的si RNA可以下調(diào)RHPN2,并抑制細胞增殖活力同時提高細胞凋亡率,但上調(diào)RHPN2水平,卻對過表達細胞的增殖活性并沒有明顯作用。于是,在對RHPN2過表達質(zhì)粒重新測序的過程中,我們發(fā)現(xiàn)其發(fā)生了位點突變,突變位點為G46A,因此我們認為,可能由于該點突變導致蛋白功能的缺失,對其功能的研究還需進一步深入。結(jié)論:本研究采用生物學信息學統(tǒng)計方法從高通量的TCGA數(shù)據(jù)庫中篩選卵巢癌差異表達基因,并結(jié)合生存期進行預后分析驗證,并經(jīng)文獻查新和應用前景篩選,最后鎖定3個新的與卵巢癌預后密切相關(guān)的基因(CD27、SPINK13和RHPN2),其中CD27、SPINK13的低表達與較短的患者生存率相關(guān),而RHPN2的高表達則提示患者不良預后相關(guān),本課題組進一步通過體外實驗方法驗證以上三種基因?qū)β殉舶┘毎鲋�、凋亡和侵襲等惡性生物學行為的影響,初步研究論證了CD27抑制卵巢癌的功能可能與其顯著抑制IL-6有關(guān);而SPINK13抑制卵巢癌細胞的作用的靶點之一可能是u PA,并與EMT進程相關(guān)。本研究有利于進一步豐富卵巢癌發(fā)生發(fā)展等惡性生物學行為的形成機制理論,新的卵巢癌預后相關(guān)基因有望為卵巢癌患者的預后判斷提供新的分子標志物,為卵巢癌的治療提供新的值得深入研究的潛在治療靶點。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.31

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本文編號：2225109