【摘要】：小桐子是具有巨大開發(fā)潛力的能源植物樹種,干旱是限制小桐子產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要環(huán)境因素。因此,弄清小桐子抗旱性形成的分子機制,獲取跟抗旱性密切相關的關鍵基因,并通過基因工程手段進行初步改良已成為急需解決的問題。本研究主要是通過借助Illumina Hiseq 2000高通量測序系統(tǒng)對小桐子模擬干旱鍛煉和空氣脅迫過程中的轉錄組進行RNA-seq解析,通過鑒定干旱響應的差異表達基因及其功能富集分析,闡明小桐子在干旱響應和適應過程中的轉錄組響應全景,進而克隆并獲得了兩個與抗旱性相關的差異表達關鍵基因,為揭示小桐子干旱鍛煉下抗旱性形成的分子機制和為后續(xù)通過基因工程手段改良小桐子提供了堅實的理論和實驗基礎。研究結果如下:1.以生長三周的小桐子幼苗為實驗材料,經(jīng)10%PEG 6000模擬干旱鍛煉48h(設置5個取樣點:0 h、6 h、12 h、24 h、48 h),之后轉入空氣干旱脅迫72h(設置3個取樣點:24 h、48 h、72 h),未經(jīng)干旱鍛煉的幼苗同樣進行空氣干旱脅迫72 h,并于脅迫結束后取樣。每份葉片樣本均取自5株獨立植株,均勻混樣,記為三次生物學重復,用于cDNA文庫構建和RNA-seq測序。經(jīng)過濾去除低質量reads后,每個cDNA文庫產(chǎn)出clean reads平均數(shù)目為11,933,126條,通過與參考基因組和多重數(shù)據(jù)庫比對,共計26,979條獲得功能注釋。2.使用NOISeq方法進行差異表達基因分析發(fā)現(xiàn),在干旱鍛煉階段,與對照0 h相比,鍛煉6 h、12 h、24 h、48 h分別有27、67、74、186個基因表達下調同時分別有36、76、122、166個基因表達上調;在隨后進行的空氣干旱脅迫24h、48 h、72 h,下調表達基因數(shù)量為671、742、696,同時有411、409、375個基因表達上調。共鑒定出1,573個干旱響應基因,其中上調表達基因主要涉及大量滲透調節(jié)蛋白、激素生物合成、抗氧化系統(tǒng)、轉錄因子等。3.對干旱響應的差異表達基因進行KEGG和基因本體富集分析,發(fā)現(xiàn)干旱鍛煉促進了轉錄調控和激素信號調節(jié),表現(xiàn)出大量轉錄因子(如WRKY、bHLH、NF、C3H、HD-ZIP等)以及激素生物合成與信號轉導相關元件(如SAMS、ACO、ARPs、GA20 oxidase、SnRK、ZEP等)的上調表達。此外,鍛煉誘導基因還廣泛參與了滲透調節(jié)物質(如半乳糖、海藻糖和甜菜堿等)及抗逆蛋白(如nsLTPs、HSPs等)的生物合成,抗氧化系統(tǒng)(如GST、GPX、SOD、氧還蛋白和金屬硫蛋白等)的活化、脂肪酸的生物合成(CER、WSD、GPAT、FAD、細胞色素P450等)以及糖類的代謝和轉化(如RuBisco、PGK等)。4.為了驗證RNA-seq數(shù)據(jù)的可信性,我們挑選了22個基因進行qRT-PCR分析,所選基因的表達水平、模式和功能盡量隨機。結果顯示qPCR數(shù)據(jù)與RNA-seq數(shù)據(jù)的平均相關系數(shù)為0.8以上,表明RNA-seq數(shù)據(jù)是可信的。5.LEA蛋白是一類跟抗逆性緊密相關的蛋白,在不同物種中都有大量發(fā)現(xiàn)。我們的RNA-seq分析結果顯示,共計6個LEA編碼基因的表達均受到干旱處理的誘導,其中XM_012232372.1在葉片中的本底表達量相對最高并且變化倍數(shù)顯著。在此基礎上,我們選擇該LEA蛋白進行基因克隆及功能驗證。序列分析可知該基因CDS序列全長為459 bp,編碼152個氨基酸的蛋白,經(jīng)特定基序和同源性序列比對可知其屬于第四組典型親水性的LEA蛋白,故命名為JcLEA4。實時熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn),該基因在小桐子幼苗的葉中受空氣干旱脅迫和ABA誘導顯著,并且其異源表達增強了酵母菌對PEG模擬干旱脅迫的耐受能力。6.GDSL酯酶/脂肪酶(GDSL esterase/lipase)是近幾年新發(fā)現(xiàn)的具有GDSL保守結構域的脂肪酶的亞家族成員。在RNA-seq分析的基礎上,我們從小桐子幼苗中克隆得到一個編碼GDSL酯酶/脂肪酶的基因JcGLIP,經(jīng)過保守結構域分析可知其為SGNH水解酶超家族/亞家族一員,CDS序列全長為1,104bp,編碼蛋白有367個氨基酸,熒光定量PCR結果可知其在空氣干旱脅迫和ABA處理的前期被大量誘導,屬于干旱快速響應基因,轉基因酵母在PEG模擬干旱脅迫下同樣表現(xiàn)出一定的抵抗能力。本研究初步證實了JcLEA4和JcGLIP基因參與了小桐子的干旱響應,并且此過程可能與ABA信號調節(jié)有關。
[Abstract]:Jatropha curcas L. is an energy plant species with great potential for development. Drought is an important environmental factor limiting the development of Jatropha curcas L. industry. The transcriptomes of Jatropha curcas during simulated drought training and air stress were analyzed by using Illumina Hiseq 2000 high-throughput sequencing system. The transcriptome response panorama of Jatropha curcas during drought response and adaptation was clarified by identifying differentially expressed genes and their functional enrichment analysis. Two differentially expressed key genes related to drought resistance were cloned and obtained, which provided a solid theoretical and experimental basis for revealing the molecular mechanism of drought resistance formation under drought stress and for subsequent improvement of Jatropha curcas L. by genetic engineering. The results were as follows: 1. After 48 hours of simulated drought stress (5 sampling points: 0 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h), 3 sampling points (24 h, 48 h, 72 h) were set up. The seedlings without drought stress were sampled for 72 h and after the stress was over. Each leaf sample was taken from 5 independent plants and mixed evenly. After removing low-quality reads, the average number of clean reads per cDNA library was 11,933,126. By comparing with the reference genome and multiple databases, a total of 26,979 functional annotations were obtained. At the stage of drought training, 27,67,74,186 genes were down-regulated and 36,76,122,166 genes were up-regulated respectively at 6,12,24 and 48 hours of exercise, compared with the control at 0 H. At the following 24,48,72 hours of air drought stress, the down-regulated gene number was 671,742,696, and 411,409,375 genes were up-regulated. 573 drought-responsive genes, of which the up-regulated genes mainly involved a large number of osmotic regulatory proteins, hormone biosynthesis, antioxidant system, transcription factors and so on. In addition, exercise-induced genes are involved in the biosynthesis of osmotic regulators (such as galactose, trehalose, betaine, etc.) and stress-resistant proteins (such as nsLTPs, HSPs, etc.). Activation of oxidative systems (such as GST, GPX, SOD, Oxoredoxin and metallothionein, etc.), biosynthesis of fatty acids (CER, WSD, GPAT, FAD, cytochrome P450, etc.), and metabolism and transformation of carbohydrates (such as RuBisco, PGK, etc.). 4. To verify the reliability of RNA-seq data, we selected 22 genes for qRT-PCR analysis, and the expression level of selected genes. The results showed that the average correlation coefficient between qPCR data and RNA-seq data was above 0.8, indicating that the RNA-seq data was reliable. 5. LEA proteins were a class of proteins closely related to stress resistance and were found in a large number of different species. The background expression of XM_0122372.1 in leaves was the highest and varied significantly after drought induction. On this basis, we selected the LEA protein for gene cloning and functional verification. Sequence analysis showed that the CDS sequence of the gene was 459 bp, encoding a protein of 152 amino acids, and was sequenced by specific sequence and homology. The sequence comparison showed that it belonged to the fourth group of typical hydrophilic LEA proteins, so it was named JcLEA4. Real-time fluorescence quantitative PCR analysis showed that the gene was significantly induced by air drought stress and ABA in the leaves of Jatropha curcas seedlings, and its heterologous expression enhanced the tolerance of yeast to PEG simulated drought stress. 6. GDSL esterase / lipase (GDSL es) Terase / lipase is a member of the lipase subfamily with a conserved domain of GDSL. Based on RNA-seq analysis, we cloned a gene JcGLIP encoding GDSL esterase / lipase from Jatropha curcas seedlings. The gene JcGLIP was identified as a member of the SGNH hydrolase superfamily / subfamily and CDS sequence by conserved domain analysis. The total length was 1,104 BP and the coding protein contained 367 amino acids. The results of fluorescence quantitative PCR showed that JcLEA4 and JcGLIP genes were induced in large quantities at the early stage of air drought stress and ABA treatment, and they belonged to drought fast response genes. Transgenic yeasts also showed resistance to PEG simulated drought stress. The drought response of Jatropha curcas L. is related to this process, and this process may be related to ABA signal regulation.
【學位授予單位】：云南師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q943.2;S794.9

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