【摘要】：小桐子是具有巨大開發(fā)潛力的能源植物樹種,干旱是限制小桐子產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要環(huán)境因素。因此,弄清小桐子抗旱性形成的分子機(jī)制,獲取跟抗旱性密切相關(guān)的關(guān)鍵基因,并通過基因工程手段進(jìn)行初步改良已成為急需解決的問題。本研究主要是通過借助Illumina Hiseq 2000高通量測(cè)序系統(tǒng)對(duì)小桐子模擬干旱鍛煉和空氣脅迫過程中的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行RNA-seq解析,通過鑒定干旱響應(yīng)的差異表達(dá)基因及其功能富集分析,闡明小桐子在干旱響應(yīng)和適應(yīng)過程中的轉(zhuǎn)錄組響應(yīng)全景,進(jìn)而克隆并獲得了兩個(gè)與抗旱性相關(guān)的差異表達(dá)關(guān)鍵基因,為揭示小桐子干旱鍛煉下抗旱性形成的分子機(jī)制和為后續(xù)通過基因工程手段改良小桐子提供了堅(jiān)實(shí)的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下:1.以生長(zhǎng)三周的小桐子幼苗為實(shí)驗(yàn)材料,經(jīng)10%PEG 6000模擬干旱鍛煉48h(設(shè)置5個(gè)取樣點(diǎn):0 h、6 h、12 h、24 h、48 h),之后轉(zhuǎn)入空氣干旱脅迫72h(設(shè)置3個(gè)取樣點(diǎn):24 h、48 h、72 h),未經(jīng)干旱鍛煉的幼苗同樣進(jìn)行空氣干旱脅迫72 h,并于脅迫結(jié)束后取樣。每份葉片樣本均取自5株獨(dú)立植株,均勻混樣,記為三次生物學(xué)重復(fù),用于cDNA文庫(kù)構(gòu)建和RNA-seq測(cè)序。經(jīng)過濾去除低質(zhì)量reads后,每個(gè)cDNA文庫(kù)產(chǎn)出clean reads平均數(shù)目為11,933,126條,通過與參考基因組和多重?cái)?shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),共計(jì)26,979條獲得功能注釋。2.使用NOISeq方法進(jìn)行差異表達(dá)基因分析發(fā)現(xiàn),在干旱鍛煉階段,與對(duì)照0 h相比,鍛煉6 h、12 h、24 h、48 h分別有27、67、74、186個(gè)基因表達(dá)下調(diào)同時(shí)分別有36、76、122、166個(gè)基因表達(dá)上調(diào);在隨后進(jìn)行的空氣干旱脅迫24h、48 h、72 h,下調(diào)表達(dá)基因數(shù)量為671、742、696,同時(shí)有411、409、375個(gè)基因表達(dá)上調(diào)。共鑒定出1,573個(gè)干旱響應(yīng)基因,其中上調(diào)表達(dá)基因主要涉及大量滲透調(diào)節(jié)蛋白、激素生物合成、抗氧化系統(tǒng)、轉(zhuǎn)錄因子等。3.對(duì)干旱響應(yīng)的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG和基因本體富集分析,發(fā)現(xiàn)干旱鍛煉促進(jìn)了轉(zhuǎn)錄調(diào)控和激素信號(hào)調(diào)節(jié),表現(xiàn)出大量轉(zhuǎn)錄因子(如WRKY、bHLH、NF、C3H、HD-ZIP等)以及激素生物合成與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)元件(如SAMS、ACO、ARPs、GA20 oxidase、SnRK、ZEP等)的上調(diào)表達(dá)。此外,鍛煉誘導(dǎo)基因還廣泛參與了滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)(如半乳糖、海藻糖和甜菜堿等)及抗逆蛋白(如nsLTPs、HSPs等)的生物合成,抗氧化系統(tǒng)(如GST、GPX、SOD、氧還蛋白和金屬硫蛋白等)的活化、脂肪酸的生物合成(CER、WSD、GPAT、FAD、細(xì)胞色素P450等)以及糖類的代謝和轉(zhuǎn)化(如RuBisco、PGK等)。4.為了驗(yàn)證RNA-seq數(shù)據(jù)的可信性,我們挑選了22個(gè)基因進(jìn)行qRT-PCR分析,所選基因的表達(dá)水平、模式和功能盡量隨機(jī)。結(jié)果顯示qPCR數(shù)據(jù)與RNA-seq數(shù)據(jù)的平均相關(guān)系數(shù)為0.8以上,表明RNA-seq數(shù)據(jù)是可信的。5.LEA蛋白是一類跟抗逆性緊密相關(guān)的蛋白,在不同物種中都有大量發(fā)現(xiàn)。我們的RNA-seq分析結(jié)果顯示,共計(jì)6個(gè)LEA編碼基因的表達(dá)均受到干旱處理的誘導(dǎo),其中XM_012232372.1在葉片中的本底表達(dá)量相對(duì)最高并且變化倍數(shù)顯著。在此基礎(chǔ)上,我們選擇該LEA蛋白進(jìn)行基因克隆及功能驗(yàn)證。序列分析可知該基因CDS序列全長(zhǎng)為459 bp,編碼152個(gè)氨基酸的蛋白,經(jīng)特定基序和同源性序列比對(duì)可知其屬于第四組典型親水性的LEA蛋白,故命名為JcLEA4。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn),該基因在小桐子幼苗的葉中受空氣干旱脅迫和ABA誘導(dǎo)顯著,并且其異源表達(dá)增強(qiáng)了酵母菌對(duì)PEG模擬干旱脅迫的耐受能力。6.GDSL酯酶/脂肪酶(GDSL esterase/lipase)是近幾年新發(fā)現(xiàn)的具有GDSL保守結(jié)構(gòu)域的脂肪酶的亞家族成員。在RNA-seq分析的基礎(chǔ)上,我們從小桐子幼苗中克隆得到一個(gè)編碼GDSL酯酶/脂肪酶的基因JcGLIP,經(jīng)過保守結(jié)構(gòu)域分析可知其為SGNH水解酶超家族/亞家族一員,CDS序列全長(zhǎng)為1,104bp,編碼蛋白有367個(gè)氨基酸,熒光定量PCR結(jié)果可知其在空氣干旱脅迫和ABA處理的前期被大量誘導(dǎo),屬于干旱快速響應(yīng)基因,轉(zhuǎn)基因酵母在PEG模擬干旱脅迫下同樣表現(xiàn)出一定的抵抗能力。本研究初步證實(shí)了JcLEA4和JcGLIP基因參與了小桐子的干旱響應(yīng),并且此過程可能與ABA信號(hào)調(diào)節(jié)有關(guān)。
[Abstract]:Jatropha curcas L. is an energy plant species with great potential for development. Drought is an important environmental factor limiting the development of Jatropha curcas L. industry. The transcriptomes of Jatropha curcas during simulated drought training and air stress were analyzed by using Illumina Hiseq 2000 high-throughput sequencing system. The transcriptome response panorama of Jatropha curcas during drought response and adaptation was clarified by identifying differentially expressed genes and their functional enrichment analysis. Two differentially expressed key genes related to drought resistance were cloned and obtained, which provided a solid theoretical and experimental basis for revealing the molecular mechanism of drought resistance formation under drought stress and for subsequent improvement of Jatropha curcas L. by genetic engineering. The results were as follows: 1. After 48 hours of simulated drought stress (5 sampling points: 0 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h), 3 sampling points (24 h, 48 h, 72 h) were set up. The seedlings without drought stress were sampled for 72 h and after the stress was over. Each leaf sample was taken from 5 independent plants and mixed evenly. After removing low-quality reads, the average number of clean reads per cDNA library was 11,933,126. By comparing with the reference genome and multiple databases, a total of 26,979 functional annotations were obtained. At the stage of drought training, 27,67,74,186 genes were down-regulated and 36,76,122,166 genes were up-regulated respectively at 6,12,24 and 48 hours of exercise, compared with the control at 0 H. At the following 24,48,72 hours of air drought stress, the down-regulated gene number was 671,742,696, and 411,409,375 genes were up-regulated. 573 drought-responsive genes, of which the up-regulated genes mainly involved a large number of osmotic regulatory proteins, hormone biosynthesis, antioxidant system, transcription factors and so on. In addition, exercise-induced genes are involved in the biosynthesis of osmotic regulators (such as galactose, trehalose, betaine, etc.) and stress-resistant proteins (such as nsLTPs, HSPs, etc.). Activation of oxidative systems (such as GST, GPX, SOD, Oxoredoxin and metallothionein, etc.), biosynthesis of fatty acids (CER, WSD, GPAT, FAD, cytochrome P450, etc.), and metabolism and transformation of carbohydrates (such as RuBisco, PGK, etc.). 4. To verify the reliability of RNA-seq data, we selected 22 genes for qRT-PCR analysis, and the expression level of selected genes. The results showed that the average correlation coefficient between qPCR data and RNA-seq data was above 0.8, indicating that the RNA-seq data was reliable. 5. LEA proteins were a class of proteins closely related to stress resistance and were found in a large number of different species. The background expression of XM_0122372.1 in leaves was the highest and varied significantly after drought induction. On this basis, we selected the LEA protein for gene cloning and functional verification. Sequence analysis showed that the CDS sequence of the gene was 459 bp, encoding a protein of 152 amino acids, and was sequenced by specific sequence and homology. The sequence comparison showed that it belonged to the fourth group of typical hydrophilic LEA proteins, so it was named JcLEA4. Real-time fluorescence quantitative PCR analysis showed that the gene was significantly induced by air drought stress and ABA in the leaves of Jatropha curcas seedlings, and its heterologous expression enhanced the tolerance of yeast to PEG simulated drought stress. 6. GDSL esterase / lipase (GDSL es) Terase / lipase is a member of the lipase subfamily with a conserved domain of GDSL. Based on RNA-seq analysis, we cloned a gene JcGLIP encoding GDSL esterase / lipase from Jatropha curcas seedlings. The gene JcGLIP was identified as a member of the SGNH hydrolase superfamily / subfamily and CDS sequence by conserved domain analysis. The total length was 1,104 BP and the coding protein contained 367 amino acids. The results of fluorescence quantitative PCR showed that JcLEA4 and JcGLIP genes were induced in large quantities at the early stage of air drought stress and ABA treatment, and they belonged to drought fast response genes. Transgenic yeasts also showed resistance to PEG simulated drought stress. The drought response of Jatropha curcas L. is related to this process, and this process may be related to ABA signal regulation.
【學(xué)位授予單位】：云南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q943.2;S794.9

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本文編號(hào)：2179594