【摘要】：研究背景:急性心肌梗死(AMI)是冠狀動脈性疾病(CAD)急性發(fā)作的一種表現(xiàn)形式,主要是由不穩(wěn)定性動脈粥樣硬化斑塊破裂所致。目前已知關(guān)于動脈粥樣硬化的病理機制主要涉及細胞炎癥、氧化應(yīng)激、血小板功能等多個代謝過程。盡管前期全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)發(fā)現(xiàn)CAD的發(fā)生與遺傳變異有關(guān),但這些遺傳變異僅能解釋10%的CAD發(fā)生。目前認為低頻率以及罕見的遺傳變異可能與冠心病的發(fā)生有關(guān)。SIRT2屬于sirtuin蛋白家族的一員,主要存在于哺乳動物體內(nèi),是一種高度保守依賴煙堿胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的第Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶。SIRT2在基因組穩(wěn)定性、新陳代謝、炎癥、氧化應(yīng)激、自噬以及在調(diào)節(jié)血小板及血管內(nèi)皮功能方面發(fā)揮著重要的作用。在基因表達過程中,啟動子可調(diào)節(jié)基因表達水平變化,因此,本研究推測SIRT2基因的遺傳變異在AMI的發(fā)病機制中可能存在重要的作用,力求通過研究SIRT2基因啟動子區(qū)域的遺傳變異所引起的基因表達水平的變化來探討AMI的發(fā)生與SIRT2基因的關(guān)系。研究目的:首先在兩組人群中通過測序探討低頻遺傳變異以及單核苷酸多態(tài)性(SNPs)對AMI組和對照組人群發(fā)病的影響;其次通過構(gòu)建攜帶SIRT2基因野生型及遺傳變異位點啟動子的pGL3-basic報告基因載體,檢測遺傳變異導致的基因表達水平的變化。通過對SIRT2基因啟動子遺傳及功能變異的研究,探討SIRT2基因在AMI發(fā)病機制中的作用。研究方法:1、本研究最終納入375例新發(fā)AMI病例和377例健康對照人群,分別收集兩組人群臨床基線資料并提取全基因組DNA。2、根據(jù)NCBI基因數(shù)據(jù)庫提供的人SIRT2基因啟動子序列設(shè)計引物,采用PCR方法擴增SIRT2基因啟動子目的片段,直接測序后統(tǒng)計分析SIRT2的基因序列變異。3、將測序發(fā)現(xiàn)的攜帶SIRT2基因啟動子序列變異位點及野生型目的基因片段構(gòu)建到pGL3-basic報告基因載體,將構(gòu)建好的pGL3-basic報告基因載體及內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK通過脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染HEK293及H9c2細胞,通過Promega雙熒光報告基因分析儀分析SIRT2基因啟動子的相對熒光素酶活性,檢測基因遺傳變異導致基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性的變化。研究結(jié)果:1、通過測序,共發(fā)現(xiàn)17個DNA序列變異(DSVs)位點,包括5個SNPs位點。其中發(fā)現(xiàn)3個新的雜合DSVs,分別為g.38900270AG、g.38899853CT和g.38900888_91delTAAA,僅存在于3個AMI病人中,在正常對照組中尚未發(fā)現(xiàn)。在對照組中發(fā)現(xiàn)5個新的DSVs,分別為g.38900562CT,g.38900413AC,g.38900030GA,g.38899925AC 和 g.38899852CT,而在 AMI 組中未發(fā)現(xiàn)上述DSVs。其余4個新的雜合突變位點和5個SNPs在對照組及AMI組中均有發(fā)現(xiàn),但無統(tǒng)計學意義(P0.05)。2、成功構(gòu)建pGL3-basic報告基因載體,分別為pGL3-WT(野生型SIRT2基因啟動子)、pGL3-38900907G、pGL3-38900888_91del、pGL3-38900562T、pGL3-38900413C、pGL3-38900291G、pGL3-38900270G、pGL3-38900030A、pGL3-38899925C、pGL3-38899903C、pGL3-38899853T、pGL3-38899852T 和pGL3-38899781G。3、通過脂質(zhì)體體外瞬時轉(zhuǎn)染HEK293及H9c2細胞,檢測攜帶不同DSVs的SIRT2基因啟動子的相對熒光素酶表達活性。(1)在HEK293細胞中,僅在AMI組中發(fā)現(xiàn)DSVs可影響SIRT2基因啟動子轉(zhuǎn)錄活性:g.38900888_91delTAAA(P0.05)和 g.38900270AG(P0.01)可顯著降低SIRT2基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性;g.38899853CT顯著增加SIRT2基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性(P0.01)。將僅在對照組中發(fā)現(xiàn)5個DSVs(g.38900562CT,g.38900413AC,g.38900030GA,g.38899925AC 和 g.38899852CT)轉(zhuǎn)染至HEK293細胞后,尚未發(fā)現(xiàn)可顯著改變SIRT2基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性(P0.05)。同時 4 個 DSVs[g.38900907AG(rs4803006),g.38900291CG(rs2053071),g.38899903TC和g.38899781CG]均存在于對照組及AMI組中,將其相應(yīng)的表達載體轉(zhuǎn)染至HEK293細胞后,仍未發(fā)現(xiàn)可顯著改變SIRT2基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性(P0.05)。(2)將 AMI 組中發(fā)現(xiàn)的 g.38900888_91delTAAA 和 g.38900270AG 轉(zhuǎn)染至H9c2細胞中,發(fā)現(xiàn)可顯著降低SIRT2基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性(P0.01);g.38899853CT轉(zhuǎn)染后可顯著增加SIRT2基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性(P0.01)。在AMI組及對照組出現(xiàn)相似頻率的位點g.38900907AG(rs4803006)和g.38900291CG(rs2053071)轉(zhuǎn)染至H9c2細胞后,未發(fā)現(xiàn)可顯著改變SIRT2基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性(P0.05)。研究結(jié)論:通過對SIRT2基因啟動子遺傳及功能學變異的研究發(fā)現(xiàn),在AMI病例中發(fā)現(xiàn)的低頻序列變異位點可能會影響SIRT2基因的轉(zhuǎn)錄活性,導致其表達水平的變化,進而在心肌梗死的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用,為心肌梗死的預防和治療提供了潛在的靶點。
[Abstract]:Background: acute myocardial infarction (AMI) is a manifestation of acute attack of coronary artery disease (CAD). It is mainly caused by the rupture of unstable atherosclerotic plaque. The pathological mechanism of atherosclerosis is known to be mainly involved in many metabolic processes, such as cell inflammation, oxygenation stress, platelet function, and so on. The whole genome association study (GWAS) found that the occurrence of CAD is associated with genetic variation, but these genetic variations can only explain 10% of the occurrence of CAD. Low frequency and rare genetic variation may be associated with the occurrence of coronary heart disease that.SIRT2 belongs to a member of the sirtuin family, which is mainly in mammals, and is highly conservative. The third class histone deacetylase.SIRT2 of nicotinamide adenine adenine dinucleotide (NAD+) plays an important role in genomic stability, metabolism, inflammation, oxidative stress, autophagy, and the regulation of platelet and vascular endothelial function. In the process of gene expression, promoter can regulate the change of gene expression level. Therefore, this study It is presumed that the genetic variation of SIRT2 gene may have an important role in the pathogenesis of AMI. To explore the relationship between the occurrence of AMI and the SIRT2 gene by studying the changes in the gene expression level of the genetic variation in the promoter region of the SIRT2 gene, the purpose of this study is to explore the low frequency inheritance by sequencing in two groups of people. The effect of mutation and single nucleotide polymorphism (SNPs) on the incidence of AMI and control groups; secondly, by constructing a pGL3-basic reporter vector carrying the SIRT2 gene and the promoter of the genetic variation site, the change of gene expression level caused by genetic variation was detected. The study on the genetic and functional variation of the promoter of the SIRT2 gene was carried out. The role of SIRT2 gene in the pathogenesis of AMI was investigated. 1. The study was finally included in 375 new AMI cases and 377 healthy controls. The clinical baseline data of two groups of people were collected and the whole genome DNA.2 was extracted respectively. The primers were designed according to the SIRT2 gene promoter sequence provided by the NCBI gene database, and the PCR method was used. The target fragment of SIRT2 gene promoter was amplified and sequenced to analyze the gene sequence variation.3 of SIRT2, and the sequence of mutations of the promoter sequence and the wild type target gene fragment of the SIRT2 gene were constructed to the pGL3-basic reporter gene carrier, and the constructed pGL3-basic reporter gene vector and the internal reference plasmid pRL-TK were used to pass the lipid. The plastids were co transfected with HEK293 and H9c2 cells, and the relative luciferase activity of SIRT2 promoter was analyzed by Promega double fluorescent reporter gene analyzer, and the changes of gene promoter transcriptional activity were detected by genetic variation. The results were as follows: 1, 17 DNA sequences (DSVs), including 5 SNPs loci, were found by sequencing. 3 new heterozygous DSVs, g.38900270AG, g.38899853CT and g.38900888_91delTAAA, were found only in 3 AMI patients, which were not found in the normal control group. 5 new DSVs were found in the control group, g.38900562CT, g.38900413AC, g.38900030GA, g.38899925AC and g.38899852CT in the AMI group. The remaining 4 new heterozygous mutation sites and 5 SNPs were found in the control group and the AMI group, but there was no statistical significance (P0.05).2. The pGL3-basic reporter gene carrier was successfully constructed, pGL3-WT (wild type SIRT2 gene promoter), pGL3-38900907G, pGL3-38900888_91del, pGL3-38900562T, pGL3-38900413C, pGL3-38900291G, etc. 38900030A, pGL3-38899925C, pGL3-38899903C, pGL3-38899853T, pGL3-38899852T and pGL3-38899781G.3 were transiently transfected into HEK293 and H9c2 cells in vitro by liposomes to detect the relative luciferase expression activity of the SIRT2 gene promoter with different DSVs. (1) in HEK293 cells, only in the AMI group could affect the promoter of the gene promoter. Transcriptional activity: g.38900888_91delTAAA (P0.05) and g.38900270AG (P0.01) significantly reduced the transcriptional activity of the SIRT2 gene promoter, and g.38899853CT significantly increased the transcriptional activity of the SIRT2 gene promoter (P0.01). Only 5 DSVs (g.38900562CT, g.38900413AC, g.38900030GA, P0.01) could be found in the control group. After 93 cells, there was no significant change in the transcriptional activity (P0.05) of the SIRT2 gene promoter, and 4 DSVs[g.38900907AG (rs4803006), g.38900291CG (rs2053071), g.38899903TC and g.38899781CG] all existed in the control group and the AMI group. After transfection of its corresponding expression vector to HEK293 cells, no significant changes were found in SIRT2 basis. The transcriptional activity of promoter (P0.05). (2) transfection of g.38900888_91delTAAA and g.38900270AG found in group AMI into H9c2 cells could significantly reduce the transcriptional activity of SIRT2 gene promoter (P0.01). G.38899853CT transfection could significantly increase the transcriptional activity of the SIRT2 gene promoter (P0.01). Similar to the AMI group and the control group. After transfection of frequency sites g.38900907AG (rs4803006) and g.38900291CG (rs2053071) to H9c2 cells, there was no significant change in the transcriptional activity of the SIRT2 gene promoter (P0.05). Conclusion: the study of the genetic and functional variation of the promoter of SIRT2 gene found that the low frequency sequence found in the AMI case may affect the mutation site in the AMI case. The transcriptional activity of SIRT2 gene leads to changes in its expression level and plays an important role in the occurrence and development of myocardial infarction, which provides potential targets for the prevention and treatment of myocardial infarction.
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R542.22

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本文編號：2142459