【摘要】：男性不育癥影響了全世界六分之一的育齡夫婦,而非梗阻性無精子癥是男性不育癥中比較嚴重的情況之一。目前,非梗阻性無精子癥的致病機理仍非常不清楚。前期,本實驗室在中國漢族男性非梗阻性無精子癥患者的全基因組關聯(lián)研究中,鑒定到3個能夠達到全基因組顯著性關聯(lián)(P值小于5.0x10-8)的風險位點。但男性不育癥是多基因病,僅鑒定到3個風險位點是不足以解釋其致病機理的。這可能是由遺傳異質(zhì)性而導致的結(jié)果。我們認為那些沒有達到全基因組顯著關聯(lián)的單核苷酸多態(tài)性位點也可能提示生育的相關基因�，F(xiàn)在,通過擴大樣本量(3608個非梗阻性無精子癥病例和5909個對照),應用人樣本的三階段驗證,我們又鑒定到4個與人非梗阻性無精子癥顯著關聯(lián)的風險位點。其中一個可疑的風險位點幾乎達到全基因組顯著關聯(lián)(1q42.13, rs3000811, P=7.26x10-8)。為了驗證這個位點是否影響了男性生育能力,我們通過模式動物果蠅觀察了可疑關聯(lián)位點(位于人基因組1q42.13區(qū)域)附近的相關基因CDC42BPA的果蠅同源基因gek在雄性生育方面的表型。為了能夠?qū)蜻x的單核苷酸多態(tài)性位點附近的基因進行大規(guī)模功能篩選,我們在果蠅體內(nèi)用dsRNA或者是shRNA對靶基因進行表達沉默的實驗。在果蠅中使用這種方法具有工作周期短和高通量篩選的優(yōu)勢。我們的分析結(jié)果顯示,有31.8%(7/22)的果蠅相關基因是雄性生育必需的。這些基因?qū)?個位點。這些基因中,Lar基因主要是在生殖細胞中維持精子發(fā)生,而CG12404基因、dmrt11E基因、CG6769基因、ERR基因和sfl基因主要在體細胞中發(fā)揮作用。有趣的是,ERR基因和sfl基因?qū)ΣG丸形態(tài)的發(fā)生也是必需的。有報道顯示,無精子癥是精原細胞瘤的一個高發(fā)風險因素。精原細胞瘤也是年輕男性最常見的腫瘤之一,但其發(fā)病的分子機制并不清楚。為了在全基因組關聯(lián)研究中鑒定到更多的人非梗阻性無精子癥關聯(lián)位點,我們發(fā)現(xiàn)了一個單核苷酸多態(tài)性位點(rs1887102, P=2.60x10-7)位于人FOXN3基因中。FOXN3基因是一個進化保守的基因。我們進一步通過模式動物果蠅來檢驗雄性生育能力是否需要FOXN3基因的果蠅同源基因CHES-1-like的參與。雖然CHES-1-like基因突變果蠅是可活的和可育的,且在生精過程中沒有明顯的異常,然而在生殖細胞中異位表達CHES-1-like基因卻顯著降低了雄性果蠅的生育能力。我們通過進一步的研究發(fā)現(xiàn),在異位表達CHES-1-like基因的睪丸中,精原細胞經(jīng)歷了四次有絲分裂后并沒有停止分裂,而是繼續(xù)發(fā)育并形成腫瘤樣結(jié)構(gòu)。在這些睪丸中,分化因子Bam蛋白的表達水平明顯降低,但Bam蛋白表達的區(qū)域卻明顯變大。在CHES-1-like基因異位表達的睪丸中同時降低bam基因的表達可進一步加劇了腫瘤樣結(jié)構(gòu)的形成。dad基因作為BMP信號通路的下游基因,可以拮抗dpp基因的表達水平。而dad基因的表達水平在異位表達CHES-1-like基因的睪丸中明顯上調(diào)。我們在果蠅翅盤中也發(fā)現(xiàn),異位表達CHES-1-like基因可以上調(diào)Dpp蛋白的表達水平。在睪丸中,CHES-1-like蛋白可以直接結(jié)合dpp基因啟動子區(qū)域。因此我們提出了一個模型,在生殖細胞中異位表達CHES-1-like基因可以上調(diào)Dpp蛋白的表達水平,并抑制生殖細胞的分化,最終導致精原細胞瘤的形成。我們的研究論證了那些沒有達到全基因組顯著關聯(lián)的單核苷酸多態(tài)性位點也可以為疾病相關基因提供線索,并為其功能研究提供幫助。這些結(jié)果深化了我們對人非梗阻性無精子癥患者遺傳易感性的認識,也對了解其致病機理提供了視野。
[Abstract]:Male infertility affects 1/6 of the world's couples of childbearing age, and non obstructive azoospermia is one of the most serious cases of male infertility. The pathogenesis of non obstructive azoospermia is still unclear. In the early stage, the whole genome association study in the Chinese Han male non stem azoospermia It was identified that 3 risk loci that could reach a genome-wide association (P value less than 5.0x10-8). But male infertility is a polygenic disease, and only 3 risk sites are identified to be insufficient to explain its pathogenic mechanism. This may be a result of genetic heterogeneity. We think those did not reach the significant association of the whole genome. Single nucleotide polymorphisms are also likely to be associated with fertility related genes. Now, by expanding the sample size (3608 cases of non obstructive azoospermia and 5909 controls), we have identified 4 risk sites associated with human non obstructive azoospermia with a three stage test. One of the suspected risk loci is a few. To verify the 1q42.13, rs3000811, P=7.26x10-8. In order to verify whether this site affects male fertility, we have observed the phenotype of the Drosophila homologous gene gek of the suspicious associated locus (located in the human genome 1q42.13 region) by the model animal Drosophila melanogaster homologous gene CDC42BPA in male fertility. In order to perform large-scale functional screening of candidate genes near single nucleotide polymorphisms, we used dsRNA or shRNA to silence the target gene in the Drosophila. The use of this method in Drosophila has the advantage of short work cycle and high throughput screening. Our analysis showed that 31.8% (7/22) The genes associated with Drosophila are essential for male reproduction. These genes correspond to 9 loci. In these genes, the Lar gene maintains spermatogenesis in the germ cells, while the CG12404, dmrt11E, CG6769, ERR and SFL genes are mainly used in the somatic cells. Interestingly, the ERR and SFL genes are in the form of the testis. It is also necessary. It has been reported that azoospermia is a risk factor for the high incidence of seminoma. Spermatogonial tumor is also one of the most common tumors in young men, but the molecular mechanism of its pathogenesis is not clear. In order to identify more people with non obstructive azoospermia associated sites in the whole genome association study, we A single nucleotide polymorphic loci (rs1887102, P=2.60x10-7) in human FOXN3 gene was found to be an evolutionary conserved gene. We further examined whether the male fertility was required by the model animal fruit fly to participate in the participation of the fruit fly homologous gene CHES-1-like of the FOXN3 gene. Although the CHES-1-like gene mutated to the Drosophila melanogaster, the CHES-1-like gene mutated to the fruit fly. It is viable and fertile and has no obvious abnormalities during spermatogenesis, but ectopic expression of the CHES-1-like gene in the germ cells significantly reduces the fertility of the male Drosophila. We found that in the testicles of the ectopic expression of the CHES-1-like gene, the spermatogonial cells have undergone four mitosis and did not. In these testicles, the expression level of the differentiation factor Bam protein decreased obviously, but the region of the expression of Bam protein was significantly larger in these testicles. The decrease of the expression of BAM gene in the testicles expressed in the CHES-1-like gene could further aggravate the formation of the tumor like structure of the.Dad gene. As a downstream gene of the BMP signaling pathway, the expression level of the DPP gene can be antagonized. The expression level of the dad gene is obviously up-regulated in the testicles of the ectopic CHES-1-like gene. We also found that the ectopic expression of the CHES-1-like gene in the fly winged disc can increase the level of the expression of the Dpp protein. In the testis, the CHES-1-like protein can be straight. Then we combine the DPP gene promoter region. Therefore, we have proposed a model in which the ectopic expression of the CHES-1-like gene in the germ cells can up-regulate the expression of Dpp protein and inhibit the differentiation of germ cells and eventually lead to the formation of spermatogonial tumor. Acid polymorphic loci can also provide clues for disease related genes and provide help for their functional studies. These results deepen our understanding of the genetic susceptibility to non obstructive azoospermia patients and provide a vision for understanding its pathogenesis.
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R698.2

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本文編號：2119487