【摘要】：男性不育癥影響了全世界六分之一的育齡夫婦,而非梗阻性無精子癥是男性不育癥中比較嚴(yán)重的情況之一。目前,非梗阻性無精子癥的致病機(jī)理仍非常不清楚。前期,本實(shí)驗(yàn)室在中國(guó)漢族男性非梗阻性無精子癥患者的全基因組關(guān)聯(lián)研究中,鑒定到3個(gè)能夠達(dá)到全基因組顯著性關(guān)聯(lián)(P值小于5.0x10-8)的風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)。但男性不育癥是多基因病,僅鑒定到3個(gè)風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)是不足以解釋其致病機(jī)理的。這可能是由遺傳異質(zhì)性而導(dǎo)致的結(jié)果。我們認(rèn)為那些沒有達(dá)到全基因組顯著關(guān)聯(lián)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)也可能提示生育的相關(guān)基因�，F(xiàn)在,通過擴(kuò)大樣本量(3608個(gè)非梗阻性無精子癥病例和5909個(gè)對(duì)照),應(yīng)用人樣本的三階段驗(yàn)證,我們又鑒定到4個(gè)與人非梗阻性無精子癥顯著關(guān)聯(lián)的風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)。其中一個(gè)可疑的風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)幾乎達(dá)到全基因組顯著關(guān)聯(lián)(1q42.13, rs3000811, P=7.26x10-8)。為了驗(yàn)證這個(gè)位點(diǎn)是否影響了男性生育能力,我們通過模式動(dòng)物果蠅觀察了可疑關(guān)聯(lián)位點(diǎn)(位于人基因組1q42.13區(qū)域)附近的相關(guān)基因CDC42BPA的果蠅同源基因gek在雄性生育方面的表型。為了能夠?qū)蜻x的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)附近的基因進(jìn)行大規(guī)模功能篩選,我們?cè)诠夡w內(nèi)用dsRNA或者是shRNA對(duì)靶基因進(jìn)行表達(dá)沉默的實(shí)驗(yàn)。在果蠅中使用這種方法具有工作周期短和高通量篩選的優(yōu)勢(shì)。我們的分析結(jié)果顯示,有31.8%(7/22)的果蠅相關(guān)基因是雄性生育必需的。這些基因?qū)?yīng)了9個(gè)位點(diǎn)。這些基因中,Lar基因主要是在生殖細(xì)胞中維持精子發(fā)生,而CG12404基因、dmrt11E基因、CG6769基因、ERR基因和sfl基因主要在體細(xì)胞中發(fā)揮作用。有趣的是,ERR基因和sfl基因?qū)ΣG丸形態(tài)的發(fā)生也是必需的。有報(bào)道顯示,無精子癥是精原細(xì)胞瘤的一個(gè)高發(fā)風(fēng)險(xiǎn)因素。精原細(xì)胞瘤也是年輕男性最常見的腫瘤之一,但其發(fā)病的分子機(jī)制并不清楚。為了在全基因組關(guān)聯(lián)研究中鑒定到更多的人非梗阻性無精子癥關(guān)聯(lián)位點(diǎn),我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(rs1887102, P=2.60x10-7)位于人FOXN3基因中。FOXN3基因是一個(gè)進(jìn)化保守的基因。我們進(jìn)一步通過模式動(dòng)物果蠅來檢驗(yàn)雄性生育能力是否需要FOXN3基因的果蠅同源基因CHES-1-like的參與。雖然CHES-1-like基因突變果蠅是可活的和可育的,且在生精過程中沒有明顯的異常,然而在生殖細(xì)胞中異位表達(dá)CHES-1-like基因卻顯著降低了雄性果蠅的生育能力。我們通過進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),在異位表達(dá)CHES-1-like基因的睪丸中,精原細(xì)胞經(jīng)歷了四次有絲分裂后并沒有停止分裂,而是繼續(xù)發(fā)育并形成腫瘤樣結(jié)構(gòu)。在這些睪丸中,分化因子Bam蛋白的表達(dá)水平明顯降低,但Bam蛋白表達(dá)的區(qū)域卻明顯變大。在CHES-1-like基因異位表達(dá)的睪丸中同時(shí)降低bam基因的表達(dá)可進(jìn)一步加劇了腫瘤樣結(jié)構(gòu)的形成。dad基因作為BMP信號(hào)通路的下游基因,可以拮抗dpp基因的表達(dá)水平。而dad基因的表達(dá)水平在異位表達(dá)CHES-1-like基因的睪丸中明顯上調(diào)。我們?cè)诠壋岜P中也發(fā)現(xiàn),異位表達(dá)CHES-1-like基因可以上調(diào)Dpp蛋白的表達(dá)水平。在睪丸中,CHES-1-like蛋白可以直接結(jié)合dpp基因啟動(dòng)子區(qū)域。因此我們提出了一個(gè)模型,在生殖細(xì)胞中異位表達(dá)CHES-1-like基因可以上調(diào)Dpp蛋白的表達(dá)水平,并抑制生殖細(xì)胞的分化,最終導(dǎo)致精原細(xì)胞瘤的形成。我們的研究論證了那些沒有達(dá)到全基因組顯著關(guān)聯(lián)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)也可以為疾病相關(guān)基因提供線索,并為其功能研究提供幫助。這些結(jié)果深化了我們對(duì)人非梗阻性無精子癥患者遺傳易感性的認(rèn)識(shí),也對(duì)了解其致病機(jī)理提供了視野。
[Abstract]:Male infertility affects 1/6 of the world's couples of childbearing age, and non obstructive azoospermia is one of the most serious cases of male infertility. The pathogenesis of non obstructive azoospermia is still unclear. In the early stage, the whole genome association study in the Chinese Han male non stem azoospermia It was identified that 3 risk loci that could reach a genome-wide association (P value less than 5.0x10-8). But male infertility is a polygenic disease, and only 3 risk sites are identified to be insufficient to explain its pathogenic mechanism. This may be a result of genetic heterogeneity. We think those did not reach the significant association of the whole genome. Single nucleotide polymorphisms are also likely to be associated with fertility related genes. Now, by expanding the sample size (3608 cases of non obstructive azoospermia and 5909 controls), we have identified 4 risk sites associated with human non obstructive azoospermia with a three stage test. One of the suspected risk loci is a few. To verify the 1q42.13, rs3000811, P=7.26x10-8. In order to verify whether this site affects male fertility, we have observed the phenotype of the Drosophila homologous gene gek of the suspicious associated locus (located in the human genome 1q42.13 region) by the model animal Drosophila melanogaster homologous gene CDC42BPA in male fertility. In order to perform large-scale functional screening of candidate genes near single nucleotide polymorphisms, we used dsRNA or shRNA to silence the target gene in the Drosophila. The use of this method in Drosophila has the advantage of short work cycle and high throughput screening. Our analysis showed that 31.8% (7/22) The genes associated with Drosophila are essential for male reproduction. These genes correspond to 9 loci. In these genes, the Lar gene maintains spermatogenesis in the germ cells, while the CG12404, dmrt11E, CG6769, ERR and SFL genes are mainly used in the somatic cells. Interestingly, the ERR and SFL genes are in the form of the testis. It is also necessary. It has been reported that azoospermia is a risk factor for the high incidence of seminoma. Spermatogonial tumor is also one of the most common tumors in young men, but the molecular mechanism of its pathogenesis is not clear. In order to identify more people with non obstructive azoospermia associated sites in the whole genome association study, we A single nucleotide polymorphic loci (rs1887102, P=2.60x10-7) in human FOXN3 gene was found to be an evolutionary conserved gene. We further examined whether the male fertility was required by the model animal fruit fly to participate in the participation of the fruit fly homologous gene CHES-1-like of the FOXN3 gene. Although the CHES-1-like gene mutated to the Drosophila melanogaster, the CHES-1-like gene mutated to the fruit fly. It is viable and fertile and has no obvious abnormalities during spermatogenesis, but ectopic expression of the CHES-1-like gene in the germ cells significantly reduces the fertility of the male Drosophila. We found that in the testicles of the ectopic expression of the CHES-1-like gene, the spermatogonial cells have undergone four mitosis and did not. In these testicles, the expression level of the differentiation factor Bam protein decreased obviously, but the region of the expression of Bam protein was significantly larger in these testicles. The decrease of the expression of BAM gene in the testicles expressed in the CHES-1-like gene could further aggravate the formation of the tumor like structure of the.Dad gene. As a downstream gene of the BMP signaling pathway, the expression level of the DPP gene can be antagonized. The expression level of the dad gene is obviously up-regulated in the testicles of the ectopic CHES-1-like gene. We also found that the ectopic expression of the CHES-1-like gene in the fly winged disc can increase the level of the expression of the Dpp protein. In the testis, the CHES-1-like protein can be straight. Then we combine the DPP gene promoter region. Therefore, we have proposed a model in which the ectopic expression of the CHES-1-like gene in the germ cells can up-regulate the expression of Dpp protein and inhibit the differentiation of germ cells and eventually lead to the formation of spermatogonial tumor. Acid polymorphic loci can also provide clues for disease related genes and provide help for their functional studies. These results deepen our understanding of the genetic susceptibility to non obstructive azoospermia patients and provide a vision for understanding its pathogenesis.
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R698.2

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8 副主任醫(yī)師 劉曉麗;腎炎會(huì)引起無精子嗎[N];衛(wèi)生與生活報(bào);2003年

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本文編號(hào)：2119487