【摘要】：苯丙酮尿癥(Phenylketonuria,PKU,OMIM#261600)是一種最常見的常染色體隱性遺傳代謝病,因苯丙氨酸輕化酶(Phenylalanine Hydroxylase,PAH)基因突變導致PAH活性降低或喪失,苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe)在肝臟中代謝紊亂所致。PKU發(fā)病率有種族和地區(qū)差異,我國北方地區(qū)的PKU發(fā)病率高于南方地區(qū),而西北地區(qū)明顯高于全國平均水平,是PKU的高發(fā)區(qū)域。本論文對西北地區(qū)PKU患者的分子遺傳基礎(chǔ)進行了研究,分析了該地區(qū)PKU致病基因PAH的突變譜,明確了其突變熱點以及突變位點與PKU臨床表型的相關(guān)性,為PKU的防治奠定了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。為了篩選西北地區(qū)PKU患者中PAH基因熱點突變,建立了一種基于MassArray基因分型技術(shù)的PAH基因突變熱點的篩查方案,評價其特異性和準確性。建立了一種基于微液滴數(shù)字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)的苯丙酮尿癥無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的方法,并與常規(guī)侵入性診斷方法進行比對評價其準確性。通過本研究建立了一個集孕前或孕期PAH基因熱點突變攜帶者篩查、孕期無創(chuàng)和侵入性產(chǎn)前診斷、產(chǎn)后基因診斷為一體的PKU三級預(yù)防干預(yù)方案。我們收集整理了西北地區(qū)475個PKU家系,采用Sanger測序、MLPA方法、gap-PCR對PAH基因突變進行分析,并采用生物信息學軟件對新發(fā)現(xiàn)的突變進行功能預(yù)測,分析PAH基因突變與PKU患者表型的相關(guān)性。結(jié)果在475例PKU患者的950個等位基因中檢測到895個突變,檢出率為94.21%(95%CI,92.72%-95.70%),通過家系驗證鑒定了 128個突變,突變等位基因中頻率最高的是c.728GA(14.00%)、其次是 c.611AG(5.58%)、c.1068CA(4.95%)。74 例患者采用 MLPA 方法鑒定了PAH基因7種大片段缺失/重復突變,占總突變頻率的3.01%(27/895),其中c.-4163_-406del3758是西北地區(qū)最常見的類型,并用gap-PCR分析了大片段缺失突變的斷裂點。我們鑒定了 20個PAH基因新突變,并對其功能進行了預(yù)測。根據(jù)PKU患者的臨床分型標準將475例患者進行分型,并對患者的表型與基因突變頻率進行相關(guān)性分析,結(jié)果提示c.158GA、c.1256AG與輕度高苯丙氨酸血癥相關(guān)。為了篩選西北地區(qū)PAH基因突變頻率位于前35位的突變位點,設(shè)計了基于MassArray技術(shù)的突變分型方案,成功對其中29個突變分兩組反應(yīng)進行了分型分析,設(shè)計成功率為82.85%。對105例已明確PAH基因突變的PKU患者樣本進行MassArray分型,通過兩個Panel的檢測,29個突變均檢測到了突變樣本,MassArray基因突變分型結(jié)果均與Sanger測序結(jié)果一致,檢測準確性為100%。采用雙盲法對照實驗,對初診的50例苯丙酮尿癥患者進行MassArray技術(shù)篩查熱點突變,同時采用Sanger測序及MLPA分析進行突變驗證,50例初診的苯丙酮尿癥患者中MassArray技術(shù)檢測到74個突變等位基因,檢出率為74%(95%CI,65%-83%),基因診斷率為 54%(95%CI,40%-68%)。我們收集了 24個需要進行產(chǎn)前診斷的PKU家系,先證者及父母基因突變明確,采用傳統(tǒng)的侵入性產(chǎn)前診斷方法對胎兒進行了產(chǎn)前診斷,同時采集孕婦外周血10mL,分離孕婦血漿,提取血漿中cfDNA。侵入性產(chǎn)前診斷結(jié)果顯示了在24例胎兒中3例為受累胎兒,8例為正常胎兒,13例為致病突變雜合攜帶者。針對產(chǎn)前診斷家系PAH基因突變特點設(shè)計基于微液滴數(shù)字PCR(ddPCR)檢測方案,并對方案的靈敏度和特異性進行了評價。成功對其中8個家系進行無創(chuàng)產(chǎn)前診斷分析,無創(chuàng)產(chǎn)前結(jié)果與侵入性產(chǎn)前診斷的結(jié)果一致,未發(fā)現(xiàn)有假陽性也假陰性結(jié)果。本研究通過對475個西北地區(qū)PKU家系進行PAH基因突變研究,首次建立了西北地區(qū)苯丙酮尿癥患者基因突變譜,明確了西北地區(qū)PAH基因熱點突變區(qū)域及突變的分布特點。首次發(fā)現(xiàn)并鑒定了 20個PAH基因新的變異位點,并對這些位點進行了功能分析,豐富了PAH基因突變庫。通過基因型表型分析明確了部分突變位點與表型的相關(guān)性,此結(jié)果可以為表型預(yù)測提供一定的依據(jù)。根據(jù)西北地區(qū)PAH基因突變熱點分析建立了一種基于MassArray技術(shù)的PAH基因熱點突變檢測方法,該方案可以同時對PAH基因29個熱點突變位點進行基因分型,突變檢出率可達到74%(95%CI,65%-83%),該檢測技術(shù)操作簡單,具有高準確性和特異性,可以作為一種高通量、低成本、快速的PAH基因突變篩查和診斷的方法。本研究首次建立了一種基于ddPCR方法的PKU無創(chuàng)產(chǎn)前診斷方案,并進行了系統(tǒng)的評價,結(jié)果顯示ddPCR在cfDNA檢測方面均有高的靈敏度和特異性,是一種可靠的PKU的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷方法。
[Abstract]:In order to screen the mutation of PAH gene in the north - west region , we analyzed the mutation spectrum of PAH gene in the north - west region of China , and analyzed the correlation between the mutation of PAH gene and the phenotype of pku . The results showed that the mutation of PAH gene in the north of China was higher than the national average . According to the clinical typing criteria of the patients , 475 patients were genotyped . The results suggested that c . 158 GA , c . 1256AG were associated with mild hyperphenylalaninemia . In this study , we have established a new method for detecting the mutation of PAH gene in the Northwest China . The results show that the mutation rate of PAH gene is 74 % ( 95 % CI , 65 % -83 % ) . The results show that the mutation rate of PAH gene is 74 % ( 95 % CI , 65 % -83 % ) .
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R596.1

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本文編號：2119704