【摘要】：苯丙酮尿癥(Phenylketonuria,PKU,OMIM#261600)是一種最常見的常染色體隱性遺傳代謝病,因苯丙氨酸輕化酶(Phenylalanine Hydroxylase,PAH)基因突變導(dǎo)致PAH活性降低或喪失,苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe)在肝臟中代謝紊亂所致。PKU發(fā)病率有種族和地區(qū)差異,我國(guó)北方地區(qū)的PKU發(fā)病率高于南方地區(qū),而西北地區(qū)明顯高于全國(guó)平均水平,是PKU的高發(fā)區(qū)域。本論文對(duì)西北地區(qū)PKU患者的分子遺傳基礎(chǔ)進(jìn)行了研究,分析了該地區(qū)PKU致病基因PAH的突變譜,明確了其突變熱點(diǎn)以及突變位點(diǎn)與PKU臨床表型的相關(guān)性,為PKU的防治奠定了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。為了篩選西北地區(qū)PKU患者中PAH基因熱點(diǎn)突變,建立了一種基于MassArray基因分型技術(shù)的PAH基因突變熱點(diǎn)的篩查方案,評(píng)價(jià)其特異性和準(zhǔn)確性。建立了一種基于微液滴數(shù)字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)的苯丙酮尿癥無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的方法,并與常規(guī)侵入性診斷方法進(jìn)行比對(duì)評(píng)價(jià)其準(zhǔn)確性。通過本研究建立了一個(gè)集孕前或孕期PAH基因熱點(diǎn)突變攜帶者篩查、孕期無創(chuàng)和侵入性產(chǎn)前診斷、產(chǎn)后基因診斷為一體的PKU三級(jí)預(yù)防干預(yù)方案。我們收集整理了西北地區(qū)475個(gè)PKU家系,采用Sanger測(cè)序、MLPA方法、gap-PCR對(duì)PAH基因突變進(jìn)行分析,并采用生物信息學(xué)軟件對(duì)新發(fā)現(xiàn)的突變進(jìn)行功能預(yù)測(cè),分析PAH基因突變與PKU患者表型的相關(guān)性。結(jié)果在475例PKU患者的950個(gè)等位基因中檢測(cè)到895個(gè)突變,檢出率為94.21%(95%CI,92.72%-95.70%),通過家系驗(yàn)證鑒定了 128個(gè)突變,突變等位基因中頻率最高的是c.728GA(14.00%)、其次是 c.611AG(5.58%)、c.1068CA(4.95%)。74 例患者采用 MLPA 方法鑒定了PAH基因7種大片段缺失/重復(fù)突變,占總突變頻率的3.01%(27/895),其中c.-4163_-406del3758是西北地區(qū)最常見的類型,并用gap-PCR分析了大片段缺失突變的斷裂點(diǎn)。我們鑒定了 20個(gè)PAH基因新突變,并對(duì)其功能進(jìn)行了預(yù)測(cè)。根據(jù)PKU患者的臨床分型標(biāo)準(zhǔn)將475例患者進(jìn)行分型,并對(duì)患者的表型與基因突變頻率進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果提示c.158GA、c.1256AG與輕度高苯丙氨酸血癥相關(guān)。為了篩選西北地區(qū)PAH基因突變頻率位于前35位的突變位點(diǎn),設(shè)計(jì)了基于MassArray技術(shù)的突變分型方案,成功對(duì)其中29個(gè)突變分兩組反應(yīng)進(jìn)行了分型分析,設(shè)計(jì)成功率為82.85%。對(duì)105例已明確PAH基因突變的PKU患者樣本進(jìn)行MassArray分型,通過兩個(gè)Panel的檢測(cè),29個(gè)突變均檢測(cè)到了突變樣本,MassArray基因突變分型結(jié)果均與Sanger測(cè)序結(jié)果一致,檢測(cè)準(zhǔn)確性為100%。采用雙盲法對(duì)照實(shí)驗(yàn),對(duì)初診的50例苯丙酮尿癥患者進(jìn)行MassArray技術(shù)篩查熱點(diǎn)突變,同時(shí)采用Sanger測(cè)序及MLPA分析進(jìn)行突變驗(yàn)證,50例初診的苯丙酮尿癥患者中MassArray技術(shù)檢測(cè)到74個(gè)突變等位基因,檢出率為74%(95%CI,65%-83%),基因診斷率為 54%(95%CI,40%-68%)。我們收集了 24個(gè)需要進(jìn)行產(chǎn)前診斷的PKU家系,先證者及父母基因突變明確,采用傳統(tǒng)的侵入性產(chǎn)前診斷方法對(duì)胎兒進(jìn)行了產(chǎn)前診斷,同時(shí)采集孕婦外周血10mL,分離孕婦血漿,提取血漿中cfDNA。侵入性產(chǎn)前診斷結(jié)果顯示了在24例胎兒中3例為受累胎兒,8例為正常胎兒,13例為致病突變雜合攜帶者。針對(duì)產(chǎn)前診斷家系PAH基因突變特點(diǎn)設(shè)計(jì)基于微液滴數(shù)字PCR(ddPCR)檢測(cè)方案,并對(duì)方案的靈敏度和特異性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。成功對(duì)其中8個(gè)家系進(jìn)行無創(chuàng)產(chǎn)前診斷分析,無創(chuàng)產(chǎn)前結(jié)果與侵入性產(chǎn)前診斷的結(jié)果一致,未發(fā)現(xiàn)有假陽性也假陰性結(jié)果。本研究通過對(duì)475個(gè)西北地區(qū)PKU家系進(jìn)行PAH基因突變研究,首次建立了西北地區(qū)苯丙酮尿癥患者基因突變譜,明確了西北地區(qū)PAH基因熱點(diǎn)突變區(qū)域及突變的分布特點(diǎn)。首次發(fā)現(xiàn)并鑒定了 20個(gè)PAH基因新的變異位點(diǎn),并對(duì)這些位點(diǎn)進(jìn)行了功能分析,豐富了PAH基因突變庫。通過基因型表型分析明確了部分突變位點(diǎn)與表型的相關(guān)性,此結(jié)果可以為表型預(yù)測(cè)提供一定的依據(jù)。根據(jù)西北地區(qū)PAH基因突變熱點(diǎn)分析建立了一種基于MassArray技術(shù)的PAH基因熱點(diǎn)突變檢測(cè)方法,該方案可以同時(shí)對(duì)PAH基因29個(gè)熱點(diǎn)突變位點(diǎn)進(jìn)行基因分型,突變檢出率可達(dá)到74%(95%CI,65%-83%),該檢測(cè)技術(shù)操作簡(jiǎn)單,具有高準(zhǔn)確性和特異性,可以作為一種高通量、低成本、快速的PAH基因突變篩查和診斷的方法。本研究首次建立了一種基于ddPCR方法的PKU無創(chuàng)產(chǎn)前診斷方案,并進(jìn)行了系統(tǒng)的評(píng)價(jià),結(jié)果顯示ddPCR在cfDNA檢測(cè)方面均有高的靈敏度和特異性,是一種可靠的PKU的無創(chuàng)產(chǎn)前診斷方法。
[Abstract]:In order to screen the mutation of PAH gene in the north - west region , we analyzed the mutation spectrum of PAH gene in the north - west region of China , and analyzed the correlation between the mutation of PAH gene and the phenotype of pku . The results showed that the mutation of PAH gene in the north of China was higher than the national average . According to the clinical typing criteria of the patients , 475 patients were genotyped . The results suggested that c . 158 GA , c . 1256AG were associated with mild hyperphenylalaninemia . In this study , we have established a new method for detecting the mutation of PAH gene in the Northwest China . The results show that the mutation rate of PAH gene is 74 % ( 95 % CI , 65 % -83 % ) . The results show that the mutation rate of PAH gene is 74 % ( 95 % CI , 65 % -83 % ) .
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R596.1

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1 吳sダ，

本文編號(hào)：2119704