本文選題：體外受精-胚胎移植 + 妊娠結(jié)局��； 參考：《南方醫(yī)科大學》2016年博士論文

【摘要】：研究背景近年來,隨著經(jīng)濟社會的迅速發(fā)展,空氣、水、飲食等環(huán)境污染日趨嚴重,人們生活方式和生活習慣逐漸改變,工作壓力大、人工與藥物流產(chǎn)以及晚婚晚育、絕育術(shù)后等,導致不同程度的影響了人類生育能力。由于生育能力下降,不孕癥發(fā)生率日趨增高,已成為全球性健康和社會公共難題。20世紀80年代末期世界衛(wèi)生組織的33個研究中心對25個國家的不孕癥夫婦組織了一次采用標準化診斷的調(diào)查,結(jié)果顯示在發(fā)達國家約有5-8%的夫婦受到不孕癥的影響,而發(fā)展中國家一些地區(qū)可高達30%不孕癥的發(fā)病率。我國各省市的發(fā)病率相差亦較大,最低約4%,最高約19%,平均約10-15%,已經(jīng)成為繼心腦血管疾病、癌癥之后的第三大疾病。隨著我國二胎政策的放開,人們對生育也有了新的要求,不孕癥的人數(shù)會進一步大幅度增加,并且我國大部分地區(qū)不孕不育治療不在醫(yī)保報銷范圍,因此不孕夫婦承受著巨大的經(jīng)濟和心理壓力。上世紀生殖醫(yī)學及輔助生殖技術(shù)的逐漸興起,為不孕夫婦治療帶來新的希望,主要依據(jù)生殖內(nèi)分泌理論指導人類輔助生殖技術(shù),人工操作配子、合子以及胚胎,從而完成受孕過程,全稱為人工方法輔助完成自然過程。體外受精-胚胎移植技術(shù)(In Vitro Fertilization and Embryo Transfer, IVF-ET)的發(fā)明和應(yīng)用為成功解決全球不孕不育患者的痛苦提供了希望,為全球公共社會問題的解決提供了有利途徑。體外受精-胚胎移植受較多因素影響,存在一定的局限和風險。盡管有不斷發(fā)明的新型有效的促排卵藥物的應(yīng)用,監(jiān)測排卵技術(shù)及取卵技術(shù)的進步,新型培養(yǎng)儀器、試劑應(yīng)用,實驗室條件下獲得的卵母細胞數(shù)量增加質(zhì)量不斷優(yōu)化,受精率及胚胎卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率逐步提高,但是體外受精-胚胎移植妊娠結(jié)局是受許多因素包括遺傳因素和每個周期的妊娠率的綜合影響,因此成功幾率僅保持在30%左右,與患者和醫(yī)務(wù)人員的希望還有很大差距,也是輔助生殖技術(shù)專家努力的方向。近年來,隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展,分子生物標志物作為快速、成本效益高和敏感的診斷工具,用于預測體外受精-胚胎移植的結(jié)果有很大的潛力,但迄今為止據(jù)我們查找的文獻尚未有在IVF-ET中相關(guān)研究報道�，F(xiàn)今高通量測序技術(shù)的優(yōu)勢得以體現(xiàn),疾病研究的原有模式被打破并得以取得重大突破,實現(xiàn)了大規(guī)模、以數(shù)據(jù)為主導的工業(yè)化研究模式,為疾病的深入研究、提高疾病的探索效率提供了極大的方便,突破以往人們對疾病探索領(lǐng)域,可以為疾病病因?qū)W、發(fā)病機制以及預防、診斷、治療的研究提供更為有效的手段。RNA-seq即轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù),又被稱為全轉(zhuǎn)錄組鳥槍法測序,RNA-seq技術(shù)的開發(fā)被稱為轉(zhuǎn)錄組學測序的革命性進展。RNA-seq可以把mRNA、小RNA以及non-coding RNA等或者其中一些用高通量測序技術(shù)把它們的序列測出來,反映出它們的表達水平。因此可用于檢測和分析樣品中兒乎所有的RNA成分,為各種疾病的探索提供了新的無限價值的工具。在本研究中,我們利用基因表達分析技術(shù)聯(lián)合HiSeqTM 2000測序系統(tǒng)在10例接受IVF-ET不孕患者中進行檢測研究,分為三個階段檢測,分別為進行體外受精-胚胎移植前階段,階段Ⅰ(StageⅠ);卵巢刺激啟動階段,階段Ⅱ(StageⅡ);胚胎移植后15天,階段Ⅲ(Stage Ⅲ)。10例患者妊娠結(jié)局為5例妊娠成功,5例妊娠失敗。先進行RNA提取,RNA-seq實驗、分析,然后利用FastQC package進行原始數(shù)據(jù)的分析后選出敏感基因,再利用實時定量PCR (qRT-PCR)進行驗證的幾個檢測出差異表達基因的表達水平,并分析相關(guān)影響體外受精-胚胎移植妊娠結(jié)局的分子機制。此外,確定相關(guān)基因可能輔助檢測ⅣF-ET患者妊娠預后,尋找新型的潛在生物標志物。研究方法本研究選取的研究對象為2014年1月至2014年6月在人理人學第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學科進行體外受精-胚胎移植的不孕患者,共計10例患者入選本研究。依據(jù)體外受精-胚胎移植治療的妊娠結(jié)局分為兩組,分別為妊娠成功組(pregnancy success group,或簡稱preg group),以及妊娠失敗組(pregnancy failure group,或簡稱nopreg group),每組各5例患者。對入選患者的所有相關(guān)臨床資料進行記錄,包括年齡、身高、體重等一般資料,以及其他疾病、服藥史、家族史等。將妊娠成功組和妊娠失敗組兩組患者的樣本收集分為三個階段,分別為進行IVF-ET前階段,階段Ⅰ(Stage Ⅰ);卵巢刺激啟動階段,階段Ⅱ(Stage Ⅱ);胚胎移植后15天,階段Ⅲ(Stage Ⅲ)。卵巢刺激方案應(yīng)用標準長方案進行控制性超促排卵,陰道超聲監(jiān)測卵泡發(fā)育,卵泡成熟在陰道超聲引導下進行穿刺取卵,行常規(guī)體外授精,18小時后受精檢查,然后進行胚胎分級和碎片評估選擇優(yōu)質(zhì)胚胎進行胚胎移植,在胚胎移植后15d,通過血清中P-hCG檢測妊娠成功與否,分別檢測其峰值變化和滴度改變。妊娠35天在陰道超聲檢測胎心活動和孕囊。RNA提取、RNA-seq測序后對原始序列數(shù)據(jù)進行處理,生物信息學分析包括利用FastQC package進行原始數(shù)據(jù)的分析、基因表達注釋、差異表達基因分析、差異基因表達模式聚類分析以及GO (Gene Ontology)功能顯著性富集分析和Pathway顯著性富集分析,Real time PCR驗證差異表達基因。分析相關(guān)影響體外受精-胚胎移植妊娠結(jié)局的分子機制,并確定相關(guān)基因可能輔助檢測IVF-ET患者妊娠預后,尋找新型的潛在生物標志物。結(jié)果1妊娠成功組(preg group)和妊娠失敗組(nonpreg group)兩組一般臨床資料年齡、不孕年限、BMI、FSF/LH比值、血清E2水平、血清T水平等無統(tǒng)計學差異(P0.05)。2妊娠成功組(preg group)收集卵母細胞62個,成熟卵母細胞52個；妊娠失敗組(nonpreg group)收集卵母細胞64個,成熟卵母細胞55個；兩組成熟卵形成率比較,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。3兩組Gn天數(shù),啟動FSH劑量,Gn總量,移植胚胎數(shù),2PN受精率,優(yōu)質(zhì)胚胎率比較,差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。4 在IVF-ET前階段,階段I(Stage I)中,妊娠成功組總計收集11698976 clean reads,占原始數(shù)據(jù)總數(shù)的98.62%;妊娠失敗組總計收集26502828 clean reads,占原始數(shù)據(jù)總數(shù)的98.4%。卵巢刺激啟動階段,階段Ⅱ(Stage Ⅱ),妊娠成功組總計收集3175521 clean reads,占原始數(shù)據(jù)總數(shù)的98.55%；妊娠失敗組總計收集12139689 clean reads,占原始數(shù)據(jù)總數(shù)的98.37%。胚胎移植后15天,階段Ⅲ(Stage Ⅲ),妊娠成功組總計收集10769344 clean reads,占原始數(shù)據(jù)總數(shù)的98.62%；妊娠失敗組總計收集17021605 clean reads,占原始數(shù)據(jù)總數(shù)的98.51%。5在IVF-ET前階段Ⅰ(Stage Ⅰ),妊娠成功組和妊娠失敗組分布在參考數(shù)據(jù)庫中基因分別為45.43%和50.14%;卵巢刺激啟動階段,階段Ⅱ(StageⅡ),妊娠成功組和妊娠失敗組分布在參考數(shù)據(jù)庫中基因分別為50.17%和50.34%；胚胎移植后15天,階段Ⅲ (Stage Ⅲ),妊娠成功組和妊娠失敗組分布在參考數(shù)據(jù)庫中基因分別為48.72%和53.24%。6在三個不同階段中,和參考數(shù)據(jù)庫對比后,兩組研究對象中每個樣本中約有28-38% 100 bp長度的配對clean reads可達到至少90%-100%基因覆蓋率。主要基因類型的轉(zhuǎn)錄mRNAs表達量低,而僅有少數(shù)基因表達量較高。7經(jīng)PCA分析(主成分分析)結(jié)果顯示,妊娠失敗組和妊娠成功組在IVF-ET前階段、階段Ⅰ(Stage Ⅰ)和卵巢刺激啟動階段、階段Ⅱ(Stage Ⅱ)具有相似的特征。但是在第三階段,胚胎移植后15天,階段Ⅲ (Stage Ⅲ)與其他階段具有顯著性差異(P0.05)。8 IVF-ET前階段、階段Ⅰ,卵巢刺激啟動階段、階段Ⅱ,胚胎移植后15天、階段Ⅲ中分別共計檢測了282,208和372個差異表達基因。結(jié)果可見,階段Ⅰ中,共有130個基因表達上調(diào),152個基因表達下調(diào)；而在階段Ⅱ中,共有90個基因表達上調(diào),118個基因表達下調(diào)；而在階段Ⅲ中,共有100個基因表達上調(diào),272個基因表達下調(diào)。9 RPKM值散點圖確定存三個階段中,僅有極少的一部分基因是差異表達基因。10在階段Ⅰ,IVF-ET前階段,“劇期性進程”("rhythmic process")和“蛋白標簽”("protein tag")相關(guān)基因表達上調(diào),“電子載體活性’("electron carrier activity")相關(guān)基因表達下調(diào)。階段Ⅱ,卵巢刺激啟動階段,“突觸部分”("synapse part")、“突觸”("synapse")、“結(jié)構(gòu)分析活性”("structural molecule activity")、“抗氧化活性”("antioxidant activity")相關(guān)基因都表達下調(diào)。階段Ⅲ,胚胎移植后15大,周期性進程”("rhythmic process")、“突觸部分”("synapse part")、“突觸”("synapse")、‘排除活性”("chemorepellent activity")相關(guān)基因都表達下調(diào)。11在階段Ⅰ,IVF-ET前階段的所有差異表達基因中,282個差異表達基因分屬于23條顯著富集的通路(P0.05)。階段Ⅱ,卵巢刺激啟動階段,208個差異表達基因分屬于32條顯著富集的富集通路(P0.05)。階段Ⅲ,胚胎移植后15天,372個差異表達基因分屬于17條顯著富集的富集通路(P0.05)。12在階段Ⅰ,IVF-ET前階段,“趨化因子信號通路”("chemokine signaling pathway")和“細胞粘附分子通路”("cell adhesion molecules pathways");階段Ⅱ,卵巢刺激啟動階段,“趨化因子信號通路”("chemokine signaling pathway");階段Ⅲ,胚胎移植后15天,“卵母細胞減數(shù)分裂”("oocyte meiosis")、'‘孕酮介導的卵母細胞成熟”("progesterone-mediated oocyte maturation" pathways)等顯著富集。除此之外,多數(shù)差異表達基因和階段Ⅰ中“趨化因子信號通路”("chemokine signaling pathway")、“細胞粘附分子通路”("cell adhesion molecules pathways"),以及階段Ⅱ中“趨化因子-細胞因子受體相互作用信號通路”("cytokine-cytokine receptor interaction")、“趨化因子信號通路”("leishmariasis")、以及階段Ⅲ中“細胞周期”("cell cycle")、“卵母細胞減數(shù)分裂”("oocyte meiosis")相關(guān)。13基于KEGG富集通路分析,選擇主要組織相容性復合體-A (HLA-A)、白介素-1β (IL-1β)、主要組織相容性復合體-DQA1 (HLA-DQA1)、血紅蛋白D(HBD)、微小染色體維持缺陷蛋白4(MCM4)等5個基因?qū)θ焉锝Y(jié)局影響最為重要。14在妊娠失敗組,階段Ⅱ中,HLA-A表達降低,而在階段Ⅲ中表達急劇升高；而在妊娠成功組中,妊娠期間HLA-A表達逐漸降低,遠低于妊娠失敗組。妊娠失敗組中,HLA-DQA1在妊娠持續(xù)期間表達增加；而在妊娠成功組中,表達持續(xù)降低,但表達量始終高于妊娠失敗組。妊娠失敗組中,IL-1β在妊娠持續(xù)期間表達增加；階段Ⅰ中,妊娠成功組中IL-1β表達量顯著高于妊娠失敗組；在階段Ⅱ中,IL-1β急劇下降,而在階段Ⅲ中表達提高,但是仍舊低于妊娠失敗組。妊娠失敗組中,HBD在妊娠持續(xù)期間表達降低；在妊娠成功組中,HBD在階段Ⅰ和階段Ⅱ中始終維持較低水平,但是在階段Ⅲ中表達量急劇增加,維持在較高的水平。妊娠失敗組中,MCM4在階段Ⅲ中表達量顯著增加,而在妊娠成功組中增加并不明顯。結(jié)論1本研究利用HiSeqTM 2000測序系統(tǒng)對影響人類IVF-ET妊娠結(jié)局的基因表達進行分析,證實在IVF-ET前階段,即階段Ⅰ(StageⅠ);卵巢刺激啟動階段,階段Ⅱ(Stage Ⅱ);胚胎移植后15天,階段Ⅲ (Stage Ⅲ)三個階段的基因表達有顯著差異。2基因表達改變和機體免疫應(yīng)答、炎癥、卵母細胞減數(shù)分裂等相關(guān)。3 HBD和MCM4可作為IVF-ET妊娠結(jié)局的分子標記物。4 HLA-A和HLA-DQAl與妊娠發(fā)育持續(xù)密切相關(guān),提示HLA-A和HLA-DQAl也可作為妊娠預測的分子標記物。5本研究為進一步深入研究影響IVF-ET妊娠結(jié)局的分子機制提供了理論基礎(chǔ),并為臨床進行IVF-ET的影響因素的研究以及預后分子靶標選擇提供了新的研究方向和數(shù)據(jù)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R714.8

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9 莫璐;yだ，

本文編號：2116814