本文選題：SB轉(zhuǎn)座子 + 魚(yú)類細(xì)胞��； 參考：《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：睡美人轉(zhuǎn)座子(Sleeping Beauty transposon,SB)系統(tǒng)是一種能有效提高基因整合效率的工具。本實(shí)驗(yàn)研究了不同SB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)在魚(yú)類細(xì)胞中的整合特性。實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建了攜帶外源報(bào)告基因DsRed的SB一元順式(cis)和二元反式(trans)轉(zhuǎn)座子系統(tǒng),以不同比例的轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座酶轉(zhuǎn)染青魚(yú)鰾細(xì)胞(Mylopharyngodon piceus bladder cells,MPB)和草魚(yú)腎臟細(xì)胞(Ctenopharyngodon idellus kidney cells,CIK)。比較了不同SB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)在青魚(yú)和草魚(yú)細(xì)胞中的整合效率,分析了SB轉(zhuǎn)座子在青魚(yú)和草魚(yú)基因組中插入位點(diǎn)的特性。此外還測(cè)試了SB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)在中華鱘肌肉細(xì)胞(Acipenser sinensis muscle cells,ASM)中的整合效率。本研究表明優(yōu)化SB轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座酶的比例能提高外源基因在魚(yú)類細(xì)胞中的整合效率并快速獲得突變細(xì)胞,為在魚(yú)類細(xì)胞中采用SB轉(zhuǎn)座子建立突變體文庫(kù)提供理論基礎(chǔ)。本研究主要得到如下結(jié)果:(1)構(gòu)建了SB二元反式(trans)轉(zhuǎn)座子系統(tǒng),它包括SB轉(zhuǎn)座子pT2和SB轉(zhuǎn)座酶pSB(SB100X)兩個(gè)質(zhì)粒,還構(gòu)建了SB轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座酶在同一個(gè)質(zhì)粒的一元順式(cis)轉(zhuǎn)座子pT2_SB。SB一元和二元轉(zhuǎn)座子都能表達(dá)具有嘌呤霉素抗性的紅色熒光蛋白基因puromycin-DsRed。(2)比較了SB一元轉(zhuǎn)座子和不同比例轉(zhuǎn)座子與轉(zhuǎn)座酶的二元轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)在MPB和CIK細(xì)胞中的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率。用脂質(zhì)體Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染MPB和CIK細(xì)胞,各設(shè)置5個(gè)實(shí)驗(yàn)組。第1組:轉(zhuǎn)染一元轉(zhuǎn)座子pT2_SB(1μg);第2組:轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)座子pT2(1μg);第3組:轉(zhuǎn)染pT2(1μg):pSB=10:1;第4組:轉(zhuǎn)染pT2(1μg):pSB=2:1;第5組:轉(zhuǎn)染pT2(1μg):pSB=1:2。2 d后,通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)得到各實(shí)驗(yàn)組中SB轉(zhuǎn)座子的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率。發(fā)現(xiàn)在MPB細(xì)胞中,轉(zhuǎn)座子pT2與轉(zhuǎn)座酶pSB比例為2:1時(shí),瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高(10.8%),而一元轉(zhuǎn)座子瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率只有3.6%。在CIK細(xì)胞中,轉(zhuǎn)座子pT2與轉(zhuǎn)座酶pSB比例為10:1時(shí),瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率最高(12.8%),一元轉(zhuǎn)座子瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效率達(dá)到8.3%。(3)比較了不同SB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)在MPB和CIK細(xì)胞中對(duì)外源基因DsRed的整合效率。對(duì)MPB和CIK細(xì)胞進(jìn)行持續(xù)28 d的嘌呤霉素篩選,采用半定量PCR驗(yàn)證了DsRed在細(xì)胞中的表達(dá),熒光定量PCR檢測(cè)了DsRed在細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量,流式細(xì)胞儀檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組MPB和CIK細(xì)胞中紅色熒光細(xì)胞所占比例。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在MPB細(xì)胞中,轉(zhuǎn)座子pT2與轉(zhuǎn)座酶pSB比例為2:1時(shí),DsRed相對(duì)表達(dá)量最高,紅色熒光細(xì)胞比例也最高(81.6%),而轉(zhuǎn)染SB一元轉(zhuǎn)座子的MPB細(xì)胞出現(xiàn)生長(zhǎng)停滯。在CIK細(xì)胞中,轉(zhuǎn)座子p T2與轉(zhuǎn)座酶pSB比例為1:2時(shí),DsRed相對(duì)表達(dá)量最高,紅色熒光細(xì)胞比例也最高(94.1%)。這些結(jié)果表明在MPB和CIK細(xì)胞中SB二元轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)整合效率要高于一元轉(zhuǎn)座子。(4)運(yùn)用高效熱不對(duì)稱交互式PCR得到了SB轉(zhuǎn)座子在青魚(yú)和草魚(yú)基因組中插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列,結(jié)果發(fā)現(xiàn)SB轉(zhuǎn)座子p T2偏好于隨機(jī)插入青魚(yú)和草魚(yú)基因組的TA位置。(5)利用SB轉(zhuǎn)座子pT2和轉(zhuǎn)座酶pSB顯著提高了外源基因DsRed在中華鱘肌肉細(xì)胞ASM中的整合效率,表明SB二元反式(trans)轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)能在多種魚(yú)類細(xì)胞中提高外源基因整合效率。
[Abstract]:In this experiment , we constructed SB - 1 cis - and trans - trans - trans - trans - trans - trans - trans - trans - trans - trans - trans - trans - trans - ( trans ) transposon systems with exogenous reporter genes , and transfected the bladder cells ( MPB ) and kidney cells of grass carp ( Ctenopharyngodon idellus kidney cells ) in different proportions . The results were as follows : ( 1 ) The transfer of pT2 ( 1 渭g ) : pSB = 1 : 2.2 d . The transfection efficiency of SB transposon and transposable pSB ( 1 渭g ) : pT2 ( 1 渭g ) : pSB = 1 : 2.2 d . ( 4 ) In MPB cells , the ratio of pT2 to pSB was 1 : 2 , the ratio of red fluorescent cells was highest ( 81.6 % ) , and the ratio of red fluorescent cells was highest ( 94.1 % ) .
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2097797