本文選題：foxo3a基因編輯 + ALK6突變小鼠　； 參考：《廣西大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：研究報道,foxo3a在水牛、豬、鼠類卵泡發(fā)育啟動方面起著重要作用,foxo3a-/-雌鼠會出現(xiàn)早期全球卵巢卵泡募集,隨后會出現(xiàn)卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞提前耗盡,造成雌鼠出現(xiàn)早期卵巢功能衰竭和繼發(fā)性不孕癥。自然突變ALK6的Booroola羊即FecB突變類型,單拷貝突變(基因型B+)母羊多產(chǎn)1.11羔,雙拷貝突變(基因型BB)增加1.40-1.50只羊羔。故本研究以51bpfoxo3a基因敲除小鼠和水牛源ALK6點(diǎn)突變轉(zhuǎn)基因小鼠為模型,觀察其對小鼠產(chǎn)仔數(shù)及相關(guān)基因表達(dá)模式的影響。TALEN-foxo3a基因編輯小鼠：建立了TALEN-foxo3a基因編輯小鼠(缺失51bp)的PCR鑒定方法,瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物,foxo3a-/-基因編輯小鼠602bp單一條帶,野生小鼠653bp單一條帶,foxo3a-/+小鼠602bp和653bp兩條帶。應(yīng)用T7E1酶切斷基因編輯切口,對PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切鑒定,可以觀察到foxo3a-/+小鼠產(chǎn)生3條帶,foxo3a-/-基因編輯小鼠與野生型小鼠為單一大小不同條帶。進(jìn)一步分析653bp的野生型小鼠基因組序列酶切位點(diǎn)含有第270位、第285位和第543位3個PSTI酶切位點(diǎn),因此野生型小鼠的PCR產(chǎn)物可酶切為110bp和260bp左右的兩條帶；單敲小鼠的DNA序列能酶切為543bp、110bp和260bp左右的三條帶；雙敲小鼠DNA序列僅能酶切為543bp和110bp兩條帶。生物信息分析顯示酶切的51bp中恰好包含了foxo3a的第32位蘇氨酸位點(diǎn),一個重要的磷酸化位點(diǎn)。選擇foxo3a-/+(?)foxo3a-/+的組合進(jìn)行交配,對后代鼠進(jìn)行PCR電泳、PCR加酶切以及測序鑒定顯示：后代總生仔數(shù)43只,其中單敲陽性數(shù)位24只,單敲陽性率為55.81%,雙敲陽性數(shù)位9只,雙敲陽性率為20.93%,總陽性率為76.74%,陽性率符合孟德爾遺傳定率。選擇鑒定出foxo3a-/-母鼠,對其產(chǎn)仔數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計,共統(tǒng)計4窩,平均生仔數(shù)為7±1.02a,顯著低于野生小鼠9.71±0.71(P0.01)。單敲小鼠foxo3a-/+產(chǎn)仔數(shù)共統(tǒng)計13窩,平均生仔數(shù)為7.38±0.54只,亦顯著低于野生型小鼠(P0.05)。單敲小鼠和野生型小鼠交配共統(tǒng)計生仔數(shù)8窩,平均生仔數(shù)為7.88±0.35只。利用SPSS分析結(jié)果顯示：相對于野生型小鼠,雙敲小鼠產(chǎn)仔數(shù)顯著下降(P=0.013),單敲小鼠產(chǎn)仔數(shù)也顯著下降(P=0.015),雙敲小鼠和單敲小鼠產(chǎn)仔數(shù)差異不顯著(P=0.674)。水牛ALK6點(diǎn)突變FecB基因轉(zhuǎn)基因小鼠：為了探討ALK6點(diǎn)突變FecB基因是否能夠提高水牛繁殖力,本實驗以水牛源ALK6點(diǎn)突變轉(zhuǎn)基因小鼠為模型,觀察了其產(chǎn)仔數(shù)和基因表達(dá)變化情況。結(jié)果顯示：小鼠和水牛ALK6基因編碼的氨基酸個數(shù)相同均為502個,均無信號肽,分子質(zhì)量分別為56.9444Kda和56.9234Kda,等電點(diǎn)分別為7.48和7.78,亞細(xì)胞定位均在質(zhì)膜,在374位都有一個磷酸化位點(diǎn),第24位、第109位和第284位均有糖基化修飾位點(diǎn)。水牛源ALK6點(diǎn)突變轉(zhuǎn)基因小鼠平均生仔數(shù)為11.6±0.91只,比野生型小鼠平均生仔數(shù)9.71±0.71只多1.89只,但兩者統(tǒng)計學(xué)差異不顯著(P=0.297,P0.05)。QRT-PCR定量結(jié)果顯示水牛源ALK6點(diǎn)突變轉(zhuǎn)基因小鼠卵巢和睪丸組織中的小鼠ALK6基因相對野生型小鼠表達(dá)量均顯著下降(P0.05)。水牛源ALK6點(diǎn)突變轉(zhuǎn)基因小鼠卵巢和睪丸中水牛ALK6基因相對于鼠內(nèi)源ALK6基因表達(dá)量均較低。在水牛源ALK6點(diǎn)突變轉(zhuǎn)基因小鼠的卵巢和睪丸中,小鼠ALK6基因和水牛ALK6基因表達(dá)量之和均低于野生型小鼠卵巢和睪丸中小鼠本身ALK6基因。結(jié)論：水牛源ALK6突變轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)仔數(shù)有增加,但差異不顯著,這與轉(zhuǎn)基因小鼠卵巢中ALK6基因表達(dá)的下調(diào)有一定的聯(lián)系。結(jié)論：本研究為闡明foxo3a和FecB基因參與哺乳動物繁殖效率的分子機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:In this study , we studied the influence of foxo3a - / - female mice on the development and initiation of ovarian follicles in buffalo , pig and mouse .
The DNA sequence of single knockout mice can be digested into three bands around 543bp , 110bp and 260bp ;
The results showed that the number of FecB gene was significantly lower than that in wild mice ( P = 0 . 05 ) . The results showed that the expression of ALK6 gene in mouse ovary and testis was lower than that of wild type mouse ovary and testis . Conclusion : The expression of ALK6 gene and buffalo ALK6 gene in mouse ovary and testis is lower than that of wild type mouse ovary and testis .
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S814

【相似文獻(xiàn)】

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1 趙鮮紅;TALEN介導(dǎo)的foxo3a敲除小鼠和水牛源ALK6點(diǎn)突變轉(zhuǎn)基因小鼠的表型研究[D];廣西大學(xué);2016年

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本文編號：2067123