本文選題：DNA疫苗 + 結(jié)核分枝桿菌�。� 參考：《遵義醫(yī)學(xué)院》2017年碩士論文

【摘要】：目的:構(gòu)建抗耐藥結(jié)核重組質(zhì)粒DNA疫苗p IEMKMAGP,并初步評(píng)價(jià)其免疫效果,為臨床耐藥結(jié)核病的治療提供新的選擇。方法:(1)利用DNA重組技術(shù),將結(jié)核分枝桿菌表面抗原MPT64、Ag85B基因編碼區(qū)和野生型kat G基因編碼區(qū),以及穿孔素PRF1、顆粒溶素GNLY基因編碼區(qū)插入到真核表達(dá)載體p IRES2-EGFP中,構(gòu)建抗結(jié)核多基因真核串聯(lián)表達(dá)載體p IEMKMAGP(MPT64-Ag85B/kat G/GNLY-PRF1);(2)利用電轉(zhuǎn)化的方法,將質(zhì)粒p IEMKMAGP轉(zhuǎn)化恥垢分枝桿菌制備重組恥垢分枝桿菌菌苗;(3)利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù),將質(zhì)粒p IEMKMAGP轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)目的基因表達(dá)水平,應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測(cè)目的蛋白表達(dá)情況;(4)質(zhì)粒p IEMKMAGP免疫接種C57BL/6小鼠和SD大鼠,ELISA試劑盒檢測(cè)IL-12和IFN-γ細(xì)胞因子表達(dá)水平。結(jié)果:(1)成功構(gòu)建了抗耐藥結(jié)核多效基因工程DNA疫苗p IEMKMAGP(MPT64-Ag85B/kat G/GNLY-PRF1);(2)成功制備重組恥垢分枝桿菌菌苗;(3)目的基因MPT64/Ag85B、kat G、GNLY/PRF1在293T細(xì)胞中成功表達(dá),融合蛋白MPT64/Ag85B、融合蛋白GNLY/PRF1成功表達(dá),且融合蛋白MPT64/Ag85B可分泌表達(dá);(4)目的基因MPT64/Ag85B、kat G、GNLY/PRF1在C57BL/6小鼠組織器官m RNA水平上有一定表達(dá),但蛋白水平上未檢測(cè)到目的蛋白的表達(dá);(5)質(zhì)粒p IEMKMAGP免疫接種SD大鼠中外周血血清中的IL-12和IFN-γ細(xì)胞因子表達(dá)水平明顯升高。結(jié)論:(1)抗耐藥結(jié)核真核表達(dá)質(zhì)粒p IEMKMAGP(MPT64-Ag85B/kat G/GNLY-PRF1)作為DNA疫苗能夠在細(xì)胞水平上有效表達(dá),有望為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)新型的抗結(jié)核疫苗提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。(2)本研究構(gòu)建的抗耐藥結(jié)核DNA疫苗p IEMKMAGP(MPT64-Ag85B/kat G/GNLY-PRF1)可以引起IL-12和IFN-γ細(xì)胞因子水平的升高。
[Abstract]:Objective: to construct the recombinant plasmid DNA vaccine pIEMKMAGPand evaluate its immunological effect and provide a new choice for the treatment of drug-resistant tuberculosis. Methods using DNA recombination technique, the coding region of MPT64-Ag85B gene and wild-type kat G gene, as well as perforin PRF1, granulysin GNLY gene coding region, were inserted into eukaryotic expression vector pIRES2-EGFP. Construction of anti-tuberculosis polygene eukaryotic tandem expression vector pIEMKMAGP-MPT64-Ag85B / kat G / GNLY-PRF1 / 2) using electroporation method, plasmid pIEMKMAGP was transformed into Mycobacterium smearicum to prepare recombinant Mycobacterium smeitum vaccine, and the plasmid pIEMKMAGP was transfected into 293T cells by liposome transfection technique, and the recombinant plasmid pIEMKMAGP was transfected into 293T cells by liposome transfection. The expression levels of IL-12 and IFN- 緯 cytokines in C57BL / 6 mice and SD rats immunized with pIEMKMAGP were detected by fluorescence quantitative polymerase chain reaction (FQ-PCR) and Western blot. Results: (1) successfully constructed the multifunctional DNA vaccine pIEMKMAGPN MPT64-Ag85Br / Kat G / GNLY-PRF1 / 2) the target gene MPT64 / Ag85BY / PRF1 was successfully expressed in 293T cells, and the fusion protein MPT64 / Ag85Ag85B was successfully expressed in GNLYP PRF1, and the fusion protein GNLYP / PRF1 was successfully expressed in 293T cells. And the fusion protein MPT64 / Ag85B can secrete the expression of nong4.) the target gene MPT64 / Ag85BNY / PRF1 is expressed at the level of mRNAs in C57BL / 6 mouse tissues and organs. However, the expression of IL-12 and IFN- 緯 cytokines in peripheral blood of SD rats immunized with pIEMKMAGP was not detected at the protein level. Conclusion the eukaryotic expression plasmid pIEMKMAGPN MPT64-Ag85B / kat G / GNLY-PRF1 can be effectively expressed as a DNA vaccine. It is expected to provide an experimental basis for the further development of new anti-TB vaccine. (2) the DNA vaccine against drug-resistant tuberculosis, named as IEMKMAGPG, MPT64-Ag85Br / Kat G / GNLY-PRF1, can increase the levels of IL-12 and IFN- 緯 cytokines.
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2042949