本文選題：無精癥 + MLH1�。� 參考：《鄭州大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：男性無精癥的發(fā)病機(jī)理至今尚不明確,探討精子發(fā)生機(jī)理是目前生殖領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。研究證實(shí)精子發(fā)生過程中減數(shù)分裂前期I發(fā)生異常,會導(dǎo)致減數(shù)分裂過程紊亂和停滯,甚至無精。而且無精癥的發(fā)生可能與精母細(xì)胞減數(shù)分裂遺傳重組中的DNA錯配修復(fù)蛋白1(human mut L homologl,MLH1)有關(guān)。目前關(guān)于MLH1基因與無精癥關(guān)系的研究較少,僅限于其在睪丸組織中細(xì)胞水平的表達(dá),而關(guān)于其在無精癥患者中的分子表達(dá)及其在精子發(fā)生中的功能研究,目前尚未見報道。micro RNAs(miRNAs)以其在基因調(diào)控方面發(fā)揮重要作用的特點(diǎn)而成為目前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。miRNAs是由20個左右核苷酸序列構(gòu)成的小分子非編碼RNA,通過自身的種子序列與其靶基因的3,端非編碼區(qū)域(3,-UTR)進(jìn)行完全或不完全配對結(jié)合,降解靶基因或抑制靶基因翻譯的方式來進(jìn)行基因表達(dá)的調(diào)控。目前已發(fā)現(xiàn)有700多種miRNAs在人體中表達(dá),其中37種在睪丸組織的減數(shù)分裂期表達(dá),認(rèn)為miRNAs在精子發(fā)生中起重要作用。但是它們各自的靶基因是什么?通過何種途徑發(fā)揮調(diào)控作用的?目前尚不清楚。miR-188是在人類和小鼠中鑒定出來的一種新的miRNA,參與多種病理生理過程。有研究顯示其家族成員之一miR-188-3p在人類和小鼠的睪丸組織中表達(dá),其靶基因可能與染色體結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白有關(guān),但是具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚。通過生物信息學(xué)軟件Target Scan和Micro Cosm發(fā)現(xiàn),miR-188-3p與MLH1存在結(jié)合位點(diǎn),提示miR-188-3p可能通過調(diào)節(jié)MLH1參與精子發(fā)生過程,但目前還無相關(guān)報道,尚需研究證實(shí)。同樣miR-181b已被確認(rèn)參與多個生理發(fā)育過程,關(guān)于miR-181b的研究大多集中在腫瘤方面,顯示其可下調(diào)錯配修復(fù)基因的表達(dá)從而保持基因組的穩(wěn)定性。也有研究報道m(xù)iR-181b在動物睪丸組織中高表達(dá),但是其是否參與精子發(fā)生?MLH1基因是否與miR-188-3p和miR-181b具有調(diào)控相關(guān)性?目前國內(nèi)外均尚未見報道。因此,深入研究MLH1基因在無精癥患者睪丸組織中的表達(dá)特點(diǎn)及其與miR-188-3p和miR-181b的調(diào)控相關(guān)性,不僅為深入研究精子發(fā)生的分子調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù),也將為無精癥的臨床治療提供新思路。目的:本研究采用Real time-PCR和Western-Blot等多種分子生物學(xué)方法檢測梗阻性無精癥組、非梗阻性無精癥組和對照組的睪丸組織中miR-181b、miR-188-3p和MLH1基因的表達(dá),探討其在各組睪丸組織中的表達(dá)特點(diǎn);通過檢測過表達(dá)或抑制miR-181b和miR-188-3p對精母細(xì)胞MLH1基因表達(dá)的影響,探討miR-181b和miR-188-3p與MLH1基因的調(diào)控關(guān)系。方法:1.將收集到的各組睪丸組織取出一部分行HE染色,做成病理切片,鏡下觀察組織結(jié)構(gòu)并拍照,比較各組睪丸曲細(xì)精管內(nèi)生精細(xì)胞及精子分布特點(diǎn)及比例。2.分組:梗阻性無精癥組、非梗阻性無精癥組和對照組。不同方法檢測各組睪丸組織中MLH1的基因及蛋白表達(dá)水平。Real time-PCR技術(shù)檢測各組MLH1基因表達(dá)水平;采用Western-Blot技術(shù)檢測各組MLH1蛋白的表達(dá);采用免疫組化法比較各組MLH1蛋白的分布情況及積分光密度(Integrated option density,IOD)值。通過real time-PCR技術(shù)檢測各組miR-181b、miR-188-3p的表達(dá)。3.分別使用miR-181b和miR-188-3p的模擬物(mimic)和抑制劑(inhibitor),對小鼠GC-2spd精母細(xì)胞的miR-181b和miR-188-3p進(jìn)行過表達(dá)或表達(dá)抑制,分別比較過表達(dá)前后和表達(dá)抑制前后MLH1的3,-UTR螢光素酶活性和基因表達(dá)變化,探討miR-181b和miR-188-3p過表達(dá)或表達(dá)抑制對生精細(xì)胞MLH1表達(dá)的影響。結(jié)果:1.梗阻性無精癥組各級生精細(xì)胞比例及排列正常,生精細(xì)胞數(shù)目輕度減少,有少量成熟精子,精原細(xì)胞比例為13%;非梗阻性無精癥組生精上皮層次減少,各級生精細(xì)胞數(shù)量嚴(yán)重減少且排列紊亂,無或僅有少量精子,精原細(xì)胞比例為30%;對照組曲細(xì)精管見精原細(xì)胞、初級精母細(xì)胞、次級精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和支持細(xì)胞,有較多成熟精子,精原細(xì)胞比例為15%。2.兩組無精癥組MLH1的基因及蛋白表達(dá)均顯著高于對照組(P0.05),且非梗阻性組顯著高于梗阻性組(P0.05)。3.兩組無精癥組miR-181b和miR-188-3p的表達(dá)顯著低于對照組(P0.05),且非梗阻性組miR-181b的表達(dá)顯著低于梗阻性組(P0.05)。4.過表達(dá)miR-188-3p后MLH13,-UTR螢光素酶活性和MLH1的m RNA及蛋白表達(dá)水平均低于對照組(P0.05);miR-188-3p抑制后MLH13,-UTR螢光素酶活性和MLH1的m RNA及蛋白表達(dá)水平均高于對照組(P0.05)。miR-181b過表達(dá)或者表達(dá)抑制對MLH1的m RNA及蛋白表達(dá)水平均無顯著影響(P0.05)。結(jié)論:1.MLH1基因在無精癥睪丸組織中高表達(dá),miR-181b和miR-188-3p在無精癥睪丸組織中低表達(dá),可能參與精子發(fā)生過程。2.miR-188-3p與MLH1基因的調(diào)控有相關(guān)性,提示MLH1基因可能是miR-188-3p的靶基因。3.miR-181b與MLH1基因的調(diào)控?zé)o相關(guān)性。
[Abstract]:It has been found that miR - 188 - 3P plays an important role in human and mouse testis tissues , and it is not clear that miR - 188 - 3P plays an important role in human and mouse testis tissues . Results : 1 . The expression of miR - 181b and miR - 188 - 3P was significantly lower than that of control group ( P0.05 ) . The expression of miR - 181b and miR - 188 - 3P in non - obstructive group was significantly lower than that in control group ( P0.05 ) .
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R698.2

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本文編號：2038626