本文選題：密碼子優(yōu)化 + irrE�。� 參考：《中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)》2017年20期

【摘要】：【目的】IrrE是從耐輻射異常球菌中發(fā)現(xiàn)的全局調(diào)控蛋白,主要通過修復(fù)強(qiáng)輻射等逆境條件下DNA損傷,提高耐輻射異常球菌對(duì)極端逆境環(huán)境的抗性。研究按植物密碼子優(yōu)化的irrE后導(dǎo)入煙草對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草耐逆能力的提高,為棉花等作物耐逆育種研究打下基礎(chǔ)。【方法】按照植物密碼子優(yōu)化細(xì)菌irrE并合成基因;通過酶切連接法構(gòu)建irrE植物表達(dá)載體;通過葉盤法轉(zhuǎn)化煙草并PCR驗(yàn)證獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因再生苗;通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(q RT-PCR)分析轉(zhuǎn)基因株系中irrE的表達(dá)量;通過蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)IrrE編碼蛋白;通過NaCl和甘露醇模擬鹽處理和干旱處理分析純和轉(zhuǎn)基因株系的耐鹽耐旱性,通過測(cè)定抗逆相關(guān)生理指標(biāo)鑒定其對(duì)植物耐逆的貢獻(xiàn)�！窘Y(jié)果】按照植物密碼子對(duì)irrE進(jìn)行改造,共優(yōu)化了241個(gè)密碼子;構(gòu)建了高效植物表達(dá)載體GBI-IE;利用除草劑草甘膦作為篩選劑獲得轉(zhuǎn)基因再生幼苗,并通過PCR驗(yàn)證共獲得15個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因株系;通過q RT-PCR分析從中選取兩個(gè)表達(dá)量最高的株系GO1和GO2進(jìn)行后續(xù)的抗逆性分析;Western blot驗(yàn)證IrrE編碼蛋白在GO1和GO2中能正確翻譯。轉(zhuǎn)基因煙草耐鹽耐旱性分析:種子萌發(fā)試驗(yàn)表明,正常1/2 MS培養(yǎng)基上,轉(zhuǎn)基因株系GO1和GO2發(fā)芽率和非轉(zhuǎn)基因野生型對(duì)照之間沒有明顯的差異。然而250 mmol·L~(-1)NaCl培養(yǎng)基上GO1和GO2萌發(fā)率分別為78.8%和90.0%,野生型僅為10.3%,分別提高了68.5%和79.7%。類似地,300 mmol·L~(-1)甘露醇條件下,野生型的萌發(fā)率為39.7%,轉(zhuǎn)基因株系GO1和GO2分別提高了42.9%和50.8%;正常萌發(fā)的種子移栽到250 mmol·L~(-1) NaCl和300 mmol·L~(-1)甘露醇條件12 d后,轉(zhuǎn)基因株系根長(zhǎng)、側(cè)根數(shù)以及鮮重等生理指標(biāo)顯著高于野生型對(duì)照;溫室中正常生長(zhǎng)30 d的苗期煙草在250 mmol·L~(-1) NaCl處理下,轉(zhuǎn)基因煙草SOD、CAT活性比野生型對(duì)照分別提高了48.80%和88.55%,而MDA含量比野生型對(duì)照降低了61.61%,脅迫響應(yīng)基因Nt ABF2、Nt LEA5、Ntzfp、Nt CDPK2在GO1和GO2轉(zhuǎn)基因株系中表達(dá)量均顯著高于非轉(zhuǎn)基因野生型。和鹽處理結(jié)果類似,300 mmol·L~(-1)甘露醇的處理下,轉(zhuǎn)基因煙草的耐旱生理生化指標(biāo)均優(yōu)于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ铡！窘Y(jié)論】煙草中異源表達(dá)耐輻射異常球菌irrE可以顯著提高耐鹽耐旱性;其多效性耐非生物脅迫能力的提高表明其可作為植物耐逆基因工程的優(yōu)良基因源。
[Abstract]:[objective] IrrE is a global regulatory protein found from the actinomycetes radiodurans. It can improve the resistance to extreme stress environment by repairing DNA damage in severe radiation stress conditions. To study the improvement of stress tolerance of transgenic tobacco introduced into tobacco by irrE optimized by plant codon. [methods] to optimize bacterial irrE and synthesize genes according to plant codon, which will lay a foundation for the research of stress tolerance breeding in cotton and other crops. The irrE plant expression vector was constructed by restriction endonuclease ligation method, the positive transgenic regenerated seedlings were obtained by leaf disk method and PCR verification, and the expression of irrE in transgenic lines was analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR(q RT-PCR. IrrE coding protein was detected by Western blotting, salt tolerance of pure and transgenic lines was analyzed by NaCl and mannitol simulated salt treatment and drought treatment. The contribution to plant stress tolerance was identified by determining the physiological indexes related to stress resistance. [results] 241 codon were optimized by modifying irrE according to plant codon. The high efficient plant expression vector GBI-IEwas constructed, and 15 independent transgenic lines were obtained by PCR verification by using herbicide glyphosate as screening agent. Two of the most expressed lines, GO1 and GO2, were selected by Q RT-PCR analysis for further analysis of resistance to stress. Western blot was used to verify the correct translation of IrrE encoded proteins in GO1 and GO2. Analysis of salt tolerance of transgenic tobacco: seed germination test showed that there was no significant difference between GO1 and GO2 germination rate of transgenic lines on 1 / 2 MS medium and non-transgenic wild-type control. However, the germination rates of GO1 and GO2 on 250 mmol L~(-1)NaCl medium were 78.8% and 90.0% respectively, and the wild type was only 10.3, which increased 68.5% and 79.7%, respectively. Similarly, under the condition of mannitol, the germination rate of wild type was 39.7 and the GO1 and GO2 of transgenic lines increased by 42.9% and 50.8%, respectively, and the root length of transgenic lines was increased after transplanting the normally germinated seeds to 250 mmol Lng-1) NaCl and 300 mmol Lny-1) mannitol for 12 days. The physiological indexes of lateral root number and fresh weight were significantly higher than that of wild-type control, and the seedlings of tobacco grown normally for 30 days in greenhouse were treated with 250 mmol / L ~ (-1) NaCl. The activity of cat in transgenic tobacco was increased by 48.80% and 88.55% than that of wild type control, while the content of MDA was decreased by 61.61. The expression of stress response gene NtABF2NtLEA5NtLEA5Nt CDPK2 in GO1 and GO2 transgenic lines was significantly higher than that in non-transgenic wild-type lines. The physiological and biochemical indexes of drought tolerance of transgenic tobacco were superior to those of non-transgenic control, and the results of salt treatment were similar to those of C300 mmol / L ~ (-1) mannitol. [conclusion] the heterologous expression of irrE in tobacco could significantly improve the tolerance to salt drought. The improvement of its ability of tolerance to abiotic stress indicates that it can be used as a good gene source for plant stress tolerance gene engineering.
【作者單位】： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所;
【基金】：國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng)(2016ZX08005-004) 國(guó)家“863”計(jì)劃(2013AA102601-2)
【分類號(hào)】：Q943.2

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本文編號(hào)：1966835