本文選題：煙草 + 磷　； 參考：《南京農(nóng)業(yè)大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：磷(Phosphorus,P)是核酸、磷脂和含磷蛋白酶類等生物大分子的重要組成部分,在植物體內(nèi)的能量轉(zhuǎn)移、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、光合作用等過程發(fā)揮了重要作用,因此磷是植物生長發(fā)育必需的大量營養(yǎng)元素之一。植物根系從土壤中吸收的主要是無機(jī)態(tài)正磷酸鹽(Pi;inorganic orthophosphate),磷在土壤中非常容易被固定而沉淀,造成其在土壤中的移動性和有效性都很低,因此磷也成為植物生長發(fā)育的主要限制因子之一。在長期的進(jìn)化過程中,植物為適應(yīng)磷素缺乏的環(huán)境形成了相應(yīng)的適應(yīng)性機(jī)制,包括根系形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變、植物根際土壤化學(xué)性質(zhì)的改善、與土壤中菌根真菌形成共生體系以及在轉(zhuǎn)錄水平對眾多基因調(diào)控等方式做出相關(guān)的適應(yīng)性調(diào)整。在過去的20年里,越來越多的基因被發(fā)現(xiàn)參與維持植物的磷素動態(tài)平衡,其中microRNAs(miRs)和SPX(S YG1/PH081/XPR1)家族成員發(fā)揮著關(guān)鍵作用。MiRs是一類具有20-24個堿基,內(nèi)源表達(dá)的非編碼RNA,它是由長的莖環(huán)結(jié)構(gòu)前體經(jīng)過Dicer-like酶剪切而形成的。MiRs通常需要形成沉默復(fù)合體(silencing complex)與靶基因的mRNA進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對,對其進(jìn)行剪切或直接抑制其翻譯從而達(dá)到調(diào)控下游基因的功能。目前,在缺磷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中報道的主要有miR399和miR827。研究表明,miRs在不同物種間的保守性很強(qiáng),但同時又存在一定的變異性。在擬南芥和水稻中,miR827的靶基因分別為屬于SPX-RING家族的AtNLA和屬于SPX-MFS家族的OsSPX-MFS1/2。表明在不同物種間miR827的靶基因在進(jìn)化上發(fā)生了分離。本工作主要對茄科作物煙草中miR827和其靶基因進(jìn)行克隆,并圍繞其表達(dá)模式和維持植株磷穩(wěn)態(tài)方面的生理功能展開研究。所獲得的主要結(jié)果如下:1.通過生物信息學(xué)預(yù)測分析并成功克隆到煙草中的miR827。生物信息學(xué)分析顯示,NsmiR827a/d前體序列可以折疊成典型的莖環(huán)結(jié)構(gòu),且miR827成熟片段位于前體結(jié)構(gòu)的3'端莖結(jié)構(gòu)上。采用熒光定量RT-qPCR對煙草中的miR827進(jìn)行表達(dá)模式分析表明,NsmiR827a/dd在地上部和地下部均響應(yīng)缺磷脅迫發(fā)生上調(diào),這與miR827在擬南芥和水稻中的表達(dá)模式是一致的,說明miR827在不同物種間有很強(qiáng)的保守性。2.在miR靶基因預(yù)測網(wǎng)站預(yù)測獲得miR827在本氏煙草(Nicotianabenthamiana)中的兩個靶基因,通過同源序列比對和RLM-RACE技術(shù),獲得了林煙草中miR827兩個靶基因的全長序列。林煙草中miR827的靶基因在N端和C端分別具有一個保守的結(jié)構(gòu)域即,SPX和MFS結(jié)構(gòu)域。通過對miR827的靶基因NsSPX-MFS1和NsSPX-MFS2進(jìn)行表達(dá)模式分析表明,miR827的兩個靶基因?qū)θ绷仔盘柋憩F(xiàn)了完全相反的響應(yīng)模式,NsSPX-MFS1受缺磷下調(diào),而NsSPX-MFS2則受缺磷上調(diào),且NsSPX-MFS1/2在地上部的表達(dá)量均高于根部。3.構(gòu)建了 miR827的靶基因NsSPX-MFS1/2以及各自MFS結(jié)構(gòu)域融合GFP熒光蛋白的載體,并通過本氏煙草表皮細(xì)胞瞬時表達(dá)技術(shù)對其亞細(xì)胞水平的定位進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示,NsSPX-MFS1/2以及各自的MFS結(jié)構(gòu)域均定位在液泡膜和細(xì)胞核,表明MFS結(jié)構(gòu)域?qū)sSPX-MFS1/2的定位有重要作用。4.在五個主要磷轉(zhuǎn)運蛋白基因突變的酵母突變株EY917中進(jìn)行了 NsSPX-MFS1/2的功能回補(bǔ),研究二者在磷轉(zhuǎn)運方面的功能。結(jié)果顯示,在高磷條件下(10 mM),轉(zhuǎn)入NsSPX-MFS1/2能恢復(fù)EY917突變株的表型;而轉(zhuǎn)入NsSPX-MFS1/2各自MFS結(jié)構(gòu)域亦能部分恢復(fù)其表型,但其對突變株的回補(bǔ)能力稍弱于具有完整結(jié)構(gòu)的NsSPX-MFS1/2。這些結(jié)果表明,NsSPX-MFS1/2的MFS結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)磷的轉(zhuǎn)運,同時SPX結(jié)構(gòu)域可能對磷的轉(zhuǎn)運活性也有一定貢獻(xiàn),但其具體的功能及其分子機(jī)制還有待進(jìn)一步深入的研究發(fā)掘。5.創(chuàng)制了煙草miR827a/d的過表達(dá)株系。在不同磷濃度(100μM,1mM,5mM,10 mM)處理下,與野生型相比,miR827過表達(dá)株系在表型、根冠比和可溶性磷濃度方面均沒有顯著差異。
[Abstract]:Phosphorus ( P ) is an important component of biological macromolecules such as nucleic acids , phospholipids and phosphoproteases , and plays an important role in energy transfer , signal transduction , photosynthesis and so on in plants . NsSPX - MFS1 / 2 and their respective MFS domains were all located in vacuolar membranes and nuclei , indicating that the MFS domains play an important role in the localization of NsSPX - MFS1 / 2 . The results showed that NsSPX - MFS1 / 2 could partially restore the phenotype of the mutant strain NsSPX - MFS1 / 2 .
【學(xué)位授予單位】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S572

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本文編號：1912543