本文選題：苦蕎 + R2R3-MYB�。� 參考：《山西農業(yè)大學》2016年碩士論文

【摘要】：苦蕎是一種藥食兼用的小雜糧作物,富含高活性的黃酮醇化合物蘆丁。目前調控擬南芥黃酮醇代謝途徑的MYB轉錄因子已明確為S7亞家族,本研究從九江苦蕎cDNA中克隆得到FtMYB7和FtMYB9兩個基因,構建pBI121-35S:FtMYB7和pBI121-35S:FtMYB9過表達載體以及遺傳轉化煙草,對T0代轉基因煙草株系和九江苦蕎全生育期中黃酮醇代謝途徑關鍵酶基因進行熒光定量表達分析,以及煙草葉片瞬時表達和原位黃酮染色技術,鑒定發(fā)現(xiàn)FtMYB7和FtMYB9基因主要參與調控黃酮醇代謝途徑中關鍵酶的表達,這為進一步探究苦蕎富含高活性蘆丁化合物的調控機理提供了理論基礎。本文主要研究結果如下：(1)已克隆鑒定的FtMYB7基因:GenBank登錄號KM588379,全長cDNA序列876bp,編碼291個氨基酸;FtMYB9基因：GenBank登錄號KM588380,全長cDNA序列912bp,編碼303個氨基酸;它們均含有典型的R2R3型MYB結構域。通過構建系統(tǒng)進化樹初步確定：FtMYB7與擬南芥S1亞家族聚為一類,NCBI-Blast蛋白序列比對結果表明與丹參中SmMYB61(AGN52085)、SmMYB729(AGN52053)同源性最高,分別為為62%和61%;FtMYB9與擬南芥S7亞家族聚為一類,NCBI-Blast蛋白序列比對結果表明與葡萄中VvMYBPA1(NP_001268160)同源性最高為60%,與可可中TcMYBPA(ADD51352)同源性為58%。(2)‘九江苦蕎’全生育期各組織實時定量表達分析結果表明：FtMYB7基因在盛花期的花序中表達最高,FtUFGT1基因在全生育期的表達趨勢與FtMYB7基因的調控呈正相關;FtMYB9基因在萌發(fā)期的子葉中表達最高,FtFLS-like基因在全生育期的表達趨勢與FtMYB9基因的調控有關。(3)對轉FtMYB7、FtMYB9和FtMYB7+9基因株系的NtCHS、NtF3H和NtFLS基因進行熒光定量表達分析,結果表明：FtMYB7和FtMYB9基因對NtCHS基因的表達起負調控作用,FtMYB9基因對NtF3H、NtFLS基因的表達起正調控作用。(4)通過對野生型煙草葉片微針注射農桿菌進行瞬時表達、原位黃酮染色,結果表明分別注射35S:FtMYB7和35S:FtMYB9以及共同注射35S:FtMYB7+9后,煙草葉片均產生明顯熒光現(xiàn)象,表明有大量黃酮醇化合物合成。
[Abstract]:Tartary buckwheat (Tartary buckwheat) is a small grain crop with high activity, which is rich in flavonol and rutin. The MYB transcription factor which regulates flavonol metabolism in Arabidopsis thaliana has been identified as S7 subfamily. In this study, two genes, FtMYB7 and FtMYB9, were cloned from cDNA of Tartary Buckwheat to construct pBI121-35S:FtMYB7 and pBI121-35S:FtMYB9 overexpression vector and genetic transformation of tobacco. The key enzyme genes of flavonol metabolism pathway in transgenic tobacco lines of T 0 generation and in whole growth stage of Tartary buckwheat were analyzed by fluorescence quantitative expression, transient expression and in situ flavone staining in tobacco leaves. It was found that FtMYB7 and FtMYB9 genes were mainly involved in regulating the expression of key enzymes in flavonol metabolism pathway, which provided a theoretical basis for further exploring the regulatory mechanism of high-activity rutin compounds in Tartary buckwheat. The main results are as follows: 1) the FtMYB7 gene KM588379 has been cloned and identified, and the full-length cDNA sequence is 876 BP, encoding 291 amino acids, FtMYB9 gene accession number KM588380, full-length cDNA sequence 912bpand encoding 303 amino acids, all of which contain typical R2R3 MYB domain. By constructing phylogenetic tree, it was preliminarily confirmed that the sequence alignment of the S1-subfamily of FtMYB7 and Arabidopsis thaliana as a class of NCBI-Blast protein showed the highest homology with SmMYB61AGN52085Sm MYB729AGN52053 in Salvia miltiorrhiza. FtMYB9 and S7 subfamily of Arabidopsis thaliana showed the highest homology with VvMYBPA1 NP00001268160) and the highest homology with TcMYBPAADD51352 in cocoa. The results showed that the expression of FtMYB7 gene was the highest in the inflorescence of flowering stage, and the expression trend of FtUFGT1 gene in the whole growth stage was positively correlated with the regulation of FtMYB7 gene. FtMYB9 gene expressed the highest FtFLS-like gene in the cotyledon of germinating stage. The trend of expression was related to the regulation of FtMYB9 gene.) the fluorescent quantitative expression analysis of NtCHSN NtF3H and NtFLS genes in FtMYB7FtMYB9 and FtMYB7 9 lines was carried out. The results showed that FtMYB7 and FtMYB9 genes play a negative role in regulating the expression of NtCHS gene. FtMYB9 gene plays a positive role in regulating the expression of NtF3HntFLS gene. The results showed that after 35S:FtMYB7 and 35S:FtMYB9 were injected and 35S:FtMYB7 9 was injected together, there were obvious fluorescence phenomena in tobacco leaves, indicating that a large number of flavonol compounds were synthesized.
【學位授予單位】：山西農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q943.2;S517

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