本文選題：豬細(xì)小病毒1型(Porcine + parvovirus��； 參考：《甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus,PPV)屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬,是一種自主復(fù)制型病毒,是造成母豬繁殖障礙性疫病的主要病原體之一;母豬感染該病毒后可導(dǎo)致流產(chǎn)、木乃伊胎及死胎等,其給國內(nèi)外養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。Mary與Mahnel在1966年首次發(fā)現(xiàn)了該病毒,而后發(fā)展到世界多個(gè)國家和地區(qū);在20世紀(jì)80年代,我國的多個(gè)地方都分離發(fā)現(xiàn)豬細(xì)小病毒病。經(jīng)典的豬細(xì)小病毒病是由豬細(xì)小病毒1型(Porcine parvovirus type 1,PPV1)感染引起的,自此預(yù)防、控制并最終根除該病成了我國當(dāng)前面臨的一項(xiàng)艱巨任務(wù)。因此,如何準(zhǔn)確、及時(shí)地檢測(cè)該病原的抗體情況在該病的防控中起著重要作用。本課題開展了針對(duì)PPV1 VP2蛋白的多克隆抗體的制備和PPV1間接ELISA檢測(cè)方法的建立,為后續(xù)檢測(cè)試劑盒的研發(fā)做好鋪墊。本試驗(yàn)主要以NADL-2經(jīng)典毒株的VP2基因?yàn)閰⒖夹蛄?以豬細(xì)小病毒AV30毒株的DNA為模板,設(shè)計(jì)了編碼VP2蛋白第155-439位氨基酸的表達(dá)引物,成功克隆出VP2基因,并將其成功連接到表達(dá)載體pET-30a(+)上,轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。可溶性分析表明原核表達(dá)的融合蛋白是以包涵體的形式存在,復(fù)性后蛋白進(jìn)行Western bolt檢測(cè)表明其具有較好的抗原性;利用Ni-NTA樹脂親和層析純化重組VP2蛋白,并作為免疫原,經(jīng)四次免疫新西蘭大白兔,制備PPV1 VP2蛋白的多克隆抗體,Western bolt和間接ELISA檢測(cè)證明抗血清具有較好的特異性,抗體效價(jià)為1:25 600;免疫兔血清經(jīng)硫酸銨沉淀、Protein A樹脂親和層析純化后,得到較高純度的多克隆抗體;通過優(yōu)化反應(yīng)條件,建立了PPV1間接ELISA檢測(cè)方法,該方法不與NA-PRRSV、PCV2、PRV和CSFV抗體發(fā)生交叉反應(yīng),表明該方法具有很好的特異性;通過與國、內(nèi)外檢測(cè)PPV1抗體的同類檢測(cè)試劑盒的比較,結(jié)果顯示,該間接ELISA方法對(duì)參考陽性血清的檢出限可以達(dá)到1:800倍稀釋度,臨床敏感性為94.3%(132/140),略高于武漢科前公司的試劑盒的敏感性,低于西班牙INGEZIM PPV間接ELISA試劑盒97.1%(136/140)的敏感性;該方法臨床特異性為96%(96/100),高于武漢科前試劑盒94%(94/100),略低于西班牙INGEZIM PPV間接ELISA試劑盒的特異性97%(97/100)。與國內(nèi)外試劑盒的比較結(jié)果表明,本研究建立的PPV1間接ELISA方法具有很好的臨床特異性和敏感性,具有較大的開發(fā)利用價(jià)值。
[Abstract]:Porcine parvovirus (PPVV) belongs to the genus Parvovirus of the family Parvoviridae. It is an autonomous replicative virus and is one of the main pathogens causing reproductive disorders in sows. Infection of the virus in sows can lead to abortion, mummies and stillbirths. This virus was first discovered by Mary and Mahnel in 1966, and then developed to many countries and regions in the world. In 1980s, porcine parvovirus was isolated in many parts of China. The classical porcine parvovirus (PPV1) infection caused by porcine parvovirus type 1 (PPV1) has become a difficult task to prevent, control and eventually eradicate the disease in China. Therefore, how to accurately and timely detect the antibodies plays an important role in the prevention and control of the disease. In this paper, the preparation of polyclonal antibody against PPV1 VP2 protein and the establishment of PPV1 indirect ELISA detection method were carried out, which paved the way for the research and development of subsequent detection kit. Using the VP2 gene of classical NADL-2 strain as reference sequence and the DNA of porcine parvovirus AV30 strain as template, the expression primers encoding the 155-439 amino acid of VP2 protein were designed and the VP2 gene was cloned successfully. It was successfully ligated to the expression vector pET-30a () and transformed into BL21 (DE3) to induce the expression. Soluble analysis showed that the fusion protein expressed in prokaryotic cells existed in the form of inclusion body, and the refolding protein had good antigenicity by Western bolt detection, and the recombinant VP2 protein was purified by Ni-NTA resin affinity chromatography and used as immunogen. New Zealand white rabbits were immunized for four times. The polyclonal antibody of PPV1 VP2 protein was prepared by Western bolt and indirect ELISA. The antibody titer was 1:25 600, and the serum of immunized rabbits was purified by ammonium sulfate precipitation protein A resin affinity chromatography. The method of PPV1 indirect ELISA detection was established by optimizing the reaction conditions. The method did not cross react with NA-PRRSVG PCV2PRV and CSFV antibodies, which indicated that the method had good specificity. The results showed that the detection limit of the indirect ELISA assay for the reference positive serum could reach 1: 800 times dilution, and the clinical sensitivity was 94.33 / 132 / 140, which was slightly higher than the sensitivity of the kit of Wuhan Qianjian Company. The sensitivity of this method was lower than that of the indirect ELISA kit of Spanish INGEZIM PPV 97.6 / 140. The clinical specificity of this method was 96 / 96 / 100, which was higher than that of the pre-Wuhan kit 94 / 94 / 100, and slightly lower than the specificity of 97 / 97 / 100 of the Spanish INGEZIM PPV indirect ELISA kit. The results of comparison with domestic and foreign kits show that the indirect ELISA method developed in this study has good clinical specificity and sensitivity, and has great value of development and utilization.
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S852.651

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本文編號(hào)：1849844