發(fā)布時間：2018-05-05 23:51

  本文選題：精子 + 胚胎�。� 參考：《上海海洋大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：目前,由于生態(tài)環(huán)境變化、人工捕撈過度等因素,導(dǎo)致魚類種質(zhì)資源數(shù)量降低,所以對魚類精子和胚胎進行冷凍保存技術(shù)的研究,對魚類種質(zhì)資源保存具有重要意義。目前在魚類胚胎冷凍研究成功的主要指標是成活率的高低,由于成活率較低,魚類胚胎冷凍保存在生產(chǎn)養(yǎng)殖上并沒有得到廣泛應(yīng)用,所以對其進行相關(guān)的分子機理研究是非常必要的。本文利用魚類精子及胚胎冷凍保存技術(shù)分別對鈍吻黃蓋鰈(Pseudopleuronectes yokohamae)和海水青溕(Oryzias melastigma)進行了研究,并對0℃低溫狀態(tài)下牙鲆(Paralichthys olivaceus)胚胎的內(nèi)參基因進行了篩選及三個相關(guān)的基因CIRP、SOX9和HSP70在低溫處理的牙鲆胚胎中的表達進行了研究。本研究首先以性成熟的雄性鈍吻黃蓋鰈為實驗材料,對精子稀釋液種類及成分、抗凍劑種類、激活精子海水鹽度和冷凍精液授精實驗等進行篩選。結(jié)果表明,利用MFs-3稀釋液分別與20%1,2-PG和20%EG抗凍劑作為精子抗凍保存液時,冷凍效果最好,其精子活力分別達到最高。將PG組和EG組冷凍保存的精子解凍后分別與其卵子進行授精實驗,PG組受精率和孵化率為(80.08±0.68)%和(77.44±1.76)%,EG組則為(80.17±0.45)%和(77.92±1.33)%,與鮮精相比無顯著性差異。利用計算機輔助精子分析系統(tǒng)CASA測定MFs-3+20%PG和MFs-3+20%EG冷凍保存的鈍吻黃蓋鰈精子的各項運動參數(shù),結(jié)果顯示,二者的VCL、VSL、BCF、LIN和STR的數(shù)值差異性不顯著。本研究利用MFs-3+20%PG和MFs-3+20%EG成功冷凍了鈍吻黃蓋鰈的精子,為鈍吻黃蓋鰈精子冷凍保存技術(shù)、人工雜交育種繁殖及種質(zhì)資源庫的建立奠定了基礎(chǔ)。為了更好的研究海水魚類的胚胎冷凍保存,本實驗采用海水青溕進行研究,因為青溕屬于模式生物而且產(chǎn)卵量不隨季節(jié)的變化而變化,只要控制水溫恒定、提供合理的營養(yǎng)及光周期,產(chǎn)卵量就不會受到影響。本文首先對海水青溕的胚胎發(fā)育進行了觀察,并選取了幾個胚胎關(guān)鍵時期,分別為原腸期、神經(jīng)胚期、22-28肌節(jié)期、尾芽期、心跳期及胚體轉(zhuǎn)動期。對不同玻璃化液中抗凍劑的種類和濃度進行了篩選,目的是篩選出冷凍海水青溕的最優(yōu)玻璃化配方。結(jié)果顯示,利用50%PM的玻璃化液處理六個時期的胚胎時,胚體轉(zhuǎn)動期的孵化率高達(48.33±10.41)%。利用PG、MeOH和Gly三種滲透性抗凍劑按PM(PG:MeOH=3:2):Gly=1:1,2:1,3:1,4:1的比例進行配置玻璃化液,發(fā)現(xiàn)比例為2:1,即PMG2玻璃化液時所處理的胚胎的孵化率最高。對不同糖類的種類及濃度進行篩選時,發(fā)現(xiàn)葡萄糖對胚體轉(zhuǎn)動期的毒性最低,并且當(dāng)葡萄糖濃度為4%時胚胎的孵化率為最高,為(48.67±1.15)%。利用最終篩選出的玻璃化液PMG2G4超低溫冷凍保存胚體轉(zhuǎn)動期胚胎共309枚,解凍后保持完整胚胎的有122枚。本文從分子水平上對牙鲆胚胎在低溫狀態(tài)下的基因表達進行了研究,為魚類胚胎冷凍分子機理奠定了基礎(chǔ)。首先利用0℃及16.5℃溫度分別處理牙鲆肌節(jié)期、尾芽期和心跳期胚胎,利用GeNorm和NorFinder兩個分析內(nèi)參基因的軟件對18S rRNA、ACTB、GAPDH及EF1α四個內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進行分析。結(jié)果顯示,利用GeNorm軟件分析時四個內(nèi)參基因的穩(wěn)定性排序為18S rRNA=EF1αACTBGAPDH;利用NorFinder軟件進行分析時,內(nèi)參基因穩(wěn)定性大小排序為18S rRNAACTBEF1αGAPDH。通過GeNorm和NorFinder兩個軟件的綜合分析,認為18S rRNA在低溫處理牙鲆胚胎后穩(wěn)定性最強,要優(yōu)于其他三個內(nèi)參基因。為研究低溫對牙鲆胚胎基因表達的影響,選取對溫度適應(yīng)強的尾芽期胚胎進行0℃低溫處理,對在16.5℃正常溫度發(fā)育下的胚胎作為對照組。選取在胚胎時期有表達的三個基因CIRP、S0X9和HSP70,然后利用q RT-PCR的方法對基因在胚胎中的表達量進行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),CIRP在0℃處理0~30min內(nèi)表達量降低,之后有所升高,并在120min時CIRP的表達量升到最大值,但在處理180min時,表達量下降,與對照組沒有顯著性差異。S0X9同樣在處理30min內(nèi)表達量降低,與CIRP的不同是在120~180min表達量下降并顯著低于對照組水平。而HSP70在低溫處理的整個過程中都表現(xiàn)出表達水平升高的現(xiàn)象,與對照組有顯著性差異。本文通過研究發(fā)現(xiàn)低溫的確會改變CIRP、S0X9和HSP70表達水平。
[Abstract]:The results showed that the results showed that the results showed that the results showed that the sperm viability of fish embryos was higher than that of fresh sperm . The results showed that the results showed that the results showed that the sperm viability of fish embryos was higher than that of fresh sperm .

【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S917.4

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本文編號：1849803