本文選題：青蒿 + DXS基因家族��； 參考：《重慶大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：瘧疾是一種嚴(yán)重危害人類健康的傳染病,估計(jì)全球每年約4億人感染,接近100萬(wàn)人因此而死亡。青蒿(Artemisia annua L.)是一種中國(guó)傳統(tǒng)中藥,因其含有可用于瘧疾治療的過(guò)氧橋鍵倍半萜內(nèi)酯化合物青蒿素而聞名。然而在青蒿植株中青蒿素的含量極低,僅為干重的0.01-0.8%。植物次生代謝工程是提高青蒿素含量的有效策略之一。因此,解析青蒿素生物合成途徑基因功能,尤其是對(duì)基因家族成員功能研究將加深對(duì)青蒿素生物合成機(jī)制的解析。(1)青蒿DXS基因家族的克隆與分析青蒿素是一種倍半萜化合物,其碳骨架IPP和DMAPP來(lái)源于定位于胞質(zhì)的MVA途徑及定位于質(zhì)體的MEP途徑。近年來(lái)報(bào)道MEP途徑提供1分子的IPP構(gòu)成FPP的核心骨架,因此MEP途徑可能是青蒿素合成啟動(dòng)的關(guān)鍵。DXS是MEP途徑的第一個(gè)關(guān)鍵酶,以丙酮酸和3-磷酸甘油醛為底物催化合成1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸。在擬南芥、玉米等植物中,DXS是個(gè)小基因家族由2-4個(gè)成員組成。然而遺憾的是,目前尚未見(jiàn)青蒿DXS基因家族成員功能研究的報(bào)道。本研究采用RACE技術(shù)從青蒿中獲得了4條編碼DXS的基因序列。氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)AaDXS4與其他3個(gè)DXS具有較大差異,缺少結(jié)合GAP和TPP的保守氨基酸位點(diǎn)。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果顯示所有DXS基因家族成員聚類為3枝,其中AaDXS1屬于DXS1 clade,AaDXS2和AaDXS3屬于DXS2 clade,而Aa DXS4屬于DXS3 clade,而其中DXS2clade中DXS通常與植物次生代謝合成相關(guān)。構(gòu)建亞細(xì)胞定位載體轉(zhuǎn)化煙草原生質(zhì)體,激光共聚焦結(jié)果顯示所有AaDXS全都定位于質(zhì)體,這與MEP途徑基因編碼蛋白在植物質(zhì)體中表達(dá)的事實(shí)是吻合的。(2)篩選穩(wěn)定的內(nèi)參基因?yàn)镈XS基因家族表達(dá)模式研究奠定了基礎(chǔ)近年來(lái)熒光定量PCR因其具有高度靈敏性和特異性而成為基因表達(dá)模式分析的主流技術(shù)。在本研究中,qPCR用于分析AaDXS家族基因在不同組織或不同處理植株中表達(dá)水平差異。然而內(nèi)參基因的選擇和驗(yàn)證對(duì)于使用qPCR進(jìn)行基因表達(dá)研究是必要的前提。遺憾的是目前尚未對(duì)青蒿內(nèi)參基因的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)估。為了選擇青蒿中適合用于qPCR分析基因表達(dá)的穩(wěn)定內(nèi)參基因,我們克隆10個(gè)看家基因18S rRNA,ACT,CYP,EF1α,GAPDH,RPⅡ,RPL13D,TUA,TUB和UBQ,并且考察它們?cè)谇噍锊煌M織、低溫脅迫、熱休克、MeJA處理和ABA處理樣本中的表達(dá)穩(wěn)定性。采用兩個(gè)基于Excel開(kāi)發(fā)工具geNorm和NormFinder進(jìn)行了穩(wěn)定性分析。為了驗(yàn)證候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性,比較了不同組織樣本中使用不同內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)化的ADS基因表達(dá)水平,以及MeJA處理樣本中使用不同內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)化的ADS,cyp71av1和dbr2的表達(dá)水平。本研究的結(jié)果顯示在10個(gè)候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性表現(xiàn)多樣,暗示單個(gè)內(nèi)參基因不能同時(shí)適用于青蒿中所有樣本。通過(guò)genorm和normfinder的分析,不同組織中rpⅡef1α組合是穩(wěn)定的內(nèi)參基因。在植物激素處理的樣本中,ef1αtub推薦作為內(nèi)參基因用于分析目的基因的表達(dá)水平。此外,actef1α是最適合用于分析溫度處理樣本標(biāo)準(zhǔn)化的穩(wěn)定內(nèi)參基因組合。然而,應(yīng)用廣泛的內(nèi)參基因如18srrna和cyp表現(xiàn)出較差的穩(wěn)定性,并不適合作為內(nèi)參基因用于分析青蒿中基因表達(dá)水平研究。為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性,rpⅡef1α組合用作內(nèi)參基因分析ads基因在不同組織中的表達(dá)水平,同時(shí)ef1αtub組合用于分析meja處理青蒿中ads、cyp71av1和dbr2基因的表達(dá)水平。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)顯示在不同組織中ef1αandrpⅡ較18srrna更為穩(wěn)定,cyp是不適合用作內(nèi)參基因分析meja處理植株中基因表達(dá)水平。我們的結(jié)果將有助于分析在不同實(shí)驗(yàn)條件下青蒿中的基因表達(dá)水平。(3)青蒿dxs基因家族成員的組織表達(dá)模式和誘導(dǎo)表達(dá)模式分析基因家族成員的組織表達(dá)模式和誘導(dǎo)表達(dá)模式在一定程度上能夠解釋生物學(xué)功能上的差異。在篩選獲得穩(wěn)定內(nèi)參基因的基礎(chǔ)上,我們采用qpcr分析了青蒿不同組織,不同葉片中dxs家族基因的組織表達(dá)模式;同時(shí)利用meja、光誘導(dǎo)、機(jī)械傷害、鹽脅迫和低溫脅迫處理青蒿,分析dxs家族基因的非生物誘導(dǎo)表達(dá)模式。結(jié)果顯示aadxs3在花中的表達(dá)量最高,同時(shí)在不同葉片中aadxs3在頂芽中的表達(dá)水平很高,而在老葉中表達(dá)水平較低,這與ads基因的組織表達(dá)模式是一致的,暗示aadxs3的表達(dá)水平可能與腺毛體的密度相關(guān)。在meja處理的青蒿中aadxs2和aadxs3均能夠受到誘導(dǎo),其中aadxs3受誘導(dǎo)的表達(dá)水平更為強(qiáng)烈;aadxs3能夠快速響應(yīng)光,這一表達(dá)模式與青蒿素生物合成途徑關(guān)鍵酶基因ads和cyp71av1的表達(dá)模式相一致;aadxs1是唯一能夠受到機(jī)械傷害后表達(dá)上調(diào)的基因,而aadxs3在此處理中表達(dá)水平顯著下降。aadxs2和aadxs3能夠響應(yīng)鹽脅迫且表達(dá)水平提高,低溫脅迫早期所有成員表達(dá)水平均降低,而在6h后aadxs2和aadxs3的表達(dá)水平較對(duì)照有顯著提高。為了進(jìn)一步研究aadxs3的組織表達(dá)定位,采用fpni-pcr方法獲得aadxs2和aadxs3的啟動(dòng)子區(qū)域序列。plantcare分析顯示paadxs2存在響應(yīng)光信號(hào)、meja等激素和冷脅迫的順式作用元件;而paadxs3存在響應(yīng)光信號(hào)、meja等激素的元件外,同時(shí)還有myb、bzip和wrky等轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn);在轉(zhuǎn)基因植株中組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)paadxs3啟動(dòng)gus在擬南芥腺毛體中表達(dá)。由于青蒿素的合成就是在青蒿葉片的分泌型腺毛體,因此aadxs3的生物學(xué)功能很可能是為青蒿素等次生代謝產(chǎn)物提供前體ipp和dmapp。(4)低溫脅迫誘導(dǎo)AaDXS3表達(dá)水平提高及青蒿素含量積累的分子機(jī)制低溫是一種有害的非生物脅迫,通常會(huì)導(dǎo)致植物中次生代謝產(chǎn)物的含量的增加以增強(qiáng)抗凍性。之前有報(bào)道稱隔夜霜凍能夠有效促進(jìn)青蒿中青蒿素含量的增加。然而目前其分子機(jī)制尚不清楚。為了更好地理解低溫脅迫如何促進(jìn)青蒿素合成,我們考察了外源噴施MeJA對(duì)青蒿抗凍性的影響。在低溫脅迫時(shí)間進(jìn)程中分析了Qg源JA、青蒿素及其相關(guān)代謝產(chǎn)物的含量,同時(shí)考察了JA生物合成途徑基因、調(diào)控青蒿素生物合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和青蒿素生物合成基因的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)外源茉莉酸有效地增強(qiáng)了青蒿幼苗的抗凍性。低溫脅迫能夠誘導(dǎo)JA生物合成基因LOX1,LOX2,AOC和JAR1基因的表達(dá),從而導(dǎo)致了低溫脅迫青蒿植株中Qg源JA水平提高。增加的內(nèi)源性JA促進(jìn)了三個(gè)響應(yīng)JA信號(hào)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子ERF1,ERF2,和ORA。上述三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子均能激活青蒿素生物合成基因如ADS,CYP71AV1,DBR2和ALDH1表達(dá)。事實(shí)上,這四個(gè)青蒿生物合成相關(guān)基因在低溫脅迫植株中的表達(dá)水平較對(duì)照顯著地提高。隨后,青蒿素和相關(guān)代謝產(chǎn)物如二氫青蒿酸、青蒿素B和青蒿酸的含量在低溫脅迫青蒿中均得到提高。我們的研究為低溫脅迫調(diào)控青蒿素產(chǎn)量的分子機(jī)制提供了解釋。
[Abstract]:In this study , we have found that DXS is a kind of Chinese traditional Chinese medicine , which is one of the most effective strategies to improve the content of artemisinin . In order to verify the stability of candidate genes , we cloned 10 genes from different tissues , such as 18srrna , ACT , CYP , EF1 , TUB and UBQ . ( 3 ) The expression pattern of aadxs3 and aadxs3 were significantly higher than those of adxs3 . The expression level of aadxs3 was higher than that of adxs3 . In order to better understand how low - temperature stress promotes the synthesis of artemisinin , the expression level of artemisinin biosynthesis genes LOX1 , LOX2 , AOC and ALDH1 can be increased . In fact , it has been reported that exogenous jasmonic acid can induce the expression of artemisinin biosynthesis genes LOX1 , LOX2 , AOC and ALDH1 . In fact , these three transcription factors can induce the expression of JA biosynthetic genes LOX1 , LOX2 , AOC and ALDH1 .

【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q943.2
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本文編號(hào)：1804635