本文選題：嗜熱子囊菌 + 多糖單加氧酶�。� 參考：《山東農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：木質(zhì)纖維素是地球上最豐富的可再生資源,目前,我國(guó)每年產(chǎn)生約有6億廢棄木材和農(nóng)作物秸稈,但是人們通常用焚燒的方式處理秸稈,不能被有效利用起來(lái),這種方式不僅浪費(fèi)了資源,加重了環(huán)境污染,增加大氣中二氧化碳的含量使溫室效應(yīng)加劇。木質(zhì)纖維素生物質(zhì)可以被用熱化學(xué)處理法來(lái)除去木質(zhì)素,使半纖維素和纖維素組分松散,木質(zhì)纖維素可以被各種纖維素水解酶分解,產(chǎn)生單體糖,然后將其發(fā)酵成乙醇。在植物細(xì)胞壁中,半纖維素與木質(zhì)素以共價(jià)鍵連接,纖維素內(nèi)包含著微纖絲核心,外部包圍著半纖維素形成的基質(zhì)層,這種結(jié)構(gòu)進(jìn)一步阻礙了纖維素分解酶和半纖維素分解酶的水解作用。因此,如何高效率低成本利用木質(zhì)纖維素是我們目前面臨的重大難題。嗜熱子囊菌(Thermoascus aurantiacus)是一類可在高溫環(huán)境中生存的真菌,在40~50℃的條件下生長(zhǎng)繁殖,從嗜熱真菌中分離的熱穩(wěn)定酶,在未來(lái)的工業(yè)生產(chǎn)中具有廣泛的應(yīng)用前景。多糖單加氧酶(Polysaccharide monooxygenases,PMOs)是一類含銅氧化酶,在還原型輔因子(如維生素C)存在下可使纖維素分子氧化降解。本研究以嗜熱子囊菌為材料,提取真菌菌絲的DNA,已知兩個(gè)PMO蛋白序列,PMO4983和PMO8913,我們對(duì)兩條序列進(jìn)行分析后,發(fā)現(xiàn)兩個(gè)PMO蛋白序列均含有信號(hào)肽,因此兩個(gè)蛋白都是胞外分泌蛋白,PMO4983和PMO8913的兩條序列分別編碼228和333個(gè)氨基酸(不含信號(hào)肽),蛋白分子量預(yù)測(cè)分別為24.33KDa和34.67KDa。設(shè)計(jì)特異引物以DNA為模板擴(kuò)增得到PMO基因序列,利用基因重組的方法構(gòu)建pPICZαA-PMO表達(dá)載體,利用電擊轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒pPICZαA-PMO轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115并進(jìn)行博來(lái)霉素抗性篩選,篩選出具有高拷貝數(shù)的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子后進(jìn)行工程菌發(fā)酵以及甲醇誘導(dǎo)分泌蛋白,獲得異源表達(dá)重組蛋白。發(fā)酵進(jìn)行到第七天時(shí)收集發(fā)酵液,用硫酸銨沉淀法分離蛋白,然后用PBSA緩沖液透析兩天后離心,去除雜質(zhì)得到粗酶。將粗酶用HisTrapTM FF鎳柱層析的方法進(jìn)行洗脫,在起峰時(shí)收集蛋白,將目的蛋白分離純化出來(lái)。然后用SDS-PAGE的方法檢測(cè)蛋白純度以及分子量大小,結(jié)果顯示均為單一組分,PMO4983和PMO8913實(shí)際分子量大小分別為40.0KDa和60.1KDa。將重組蛋白分離純化并鑒定后,進(jìn)行進(jìn)一步酶學(xué)性質(zhì)檢測(cè)以及氧化性檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),以磷酸膨脹纖維素為反應(yīng)底物,這兩種多糖單加氧酶都沒有水解纖維素的能力,但是在維生素C為還原劑的條件下,PMO4983能夠?qū)⒗w維素氧化裂解為纖維寡糖,然而PMO8913的氧化活性并不明顯,因而PMO8913的性質(zhì)還有待進(jìn)一步鑒定。而在下一步實(shí)驗(yàn)中,我們不但證明了PMO4983具有氧化裂解的性質(zhì),初步確定了其氧化裂解方式,同時(shí),我們還證明了PMO4983具有提高纖維素水解酶水解活性的能力。在二價(jià)銅離子以及維生素C的環(huán)境中,用PMO4983將底物處理48h后,與傳統(tǒng)纖維素酶混合均勻,能夠發(fā)現(xiàn)PMO4983可以不同程度地提高纖維素酶的水解活性。
[Abstract]:This paper deals with the degradation of cellulose molecules by means of thermal chemical treatment . It is a kind of fungus which can survive in high temperature environment . The results showed that PMO4983 has the capability of improving the hydrolytic activity of cellulose . In the next experiment , we not only proved that PMO4983 has the properties of oxidative cleavage , but also proved that PMO4983 has the ability to improve the hydrolysis activity of cellulose hydrolases . In the next experiment , we have proved that PMO4983 has the ability to improve the hydrolysis activity of cellulose hydrolases . In the next experiment , we have proved that PMO4983 has the capability of improving the hydrolysis activity of cellulose .

【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q936;Q78

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1777454