本文選題：盾殼霉 + 核盤菌　； 參考：《華中農(nóng)業(yè)大學》2016年博士論文

【摘要】：盾殼霉(Coniothyrium minitans)作為菌核病的重要生防菌,其產(chǎn)孢和寄生能力備受研究者關(guān)注。先前實驗室為了在分子水平上研究其分生孢子產(chǎn)生及重寄生機制,構(gòu)建了野生型菌株ZS-1的T-DNA插入突變體庫。本文以插入體庫中3株產(chǎn)孢異常的轉(zhuǎn)化子ZS-1N22225,ZS-1TN1961和ZS-1TN5012為材料進行研究,實驗結(jié)果如下:菌株ZS-1N22225的菌落顏色較淺,生長慢,產(chǎn)孢量少,為T-DNA單拷貝插入突變體。通過反向PCR克隆到了Vam6/Vps39的同源基因CmVps39,CmVps39序列全長具有3315 bp,包括一個3216 bp的開放閱讀框及兩個內(nèi)含子,推定編碼1071 aa的蛋白質(zhì)。T-DNA插入在該基因的啟動子區(qū)域,使得ZS-1N22225中該基因的表達量降低。CmVps39蛋白在N端和C端分別含有一個非常保守的CNH和CLN結(jié)構(gòu)域,與其它真菌中Vps39具有高度同源性。通過基因敲除與互補技術(shù)研究CmVps39的功能,表明CmVps39敲除轉(zhuǎn)化子ΔCmVps39與T-DNA突變體ZS-1N22225的生物學性狀一致,其生長速度、分生孢子的產(chǎn)生量以及寄生核盤菌菌核的能力都明顯降低,而互補菌株的生物學性狀都得到了恢復,這表明CmVps39在盾殼霉的菌絲生長、分生孢子的產(chǎn)生及重寄生過程中都具有十分重要的作用。進一步的研究發(fā)現(xiàn),CmVps39定位于液泡,ΔCmVps39突變體的液泡不能融合成核心大液泡,而表現(xiàn)為眾多小囊泡無規(guī)律的分布。同時,發(fā)現(xiàn)基因CmVps39不僅能調(diào)控液泡的形態(tài),也具有維持滲透和pH平衡的作用。此外,研究發(fā)現(xiàn)基因CmVps39還參與到細胞自噬過程,該基因的缺失導致細胞自噬的程度減弱,從而影響了盾殼霉的產(chǎn)孢、孢子萌發(fā)和重寄生能力。菌株ZS-1TN1961生長正常,菌落顏色偏白,是T-DNA單拷貝插入的突變體。采用hiTAIL-PCR技術(shù)克隆到了T-DNA插入位點的左側(cè)序列,對其進行分析,發(fā)現(xiàn)T-DNA破壞了一個可能的基因,該序列具有1327 bp,包括一個1131 bp的開放閱讀框以及三個內(nèi)含子,推定編碼一個376 aa的假定蛋白,此假定蛋白包含一個非常保守的Aim24結(jié)構(gòu)域,因此命名此基因為CmAim24。T-DNA插入在基因CmAim24的編碼區(qū)域,距離起始密碼子(ATG)46 nt。進一步通過基因敲除和互補技術(shù)對該基因的功能進行研究,發(fā)現(xiàn)該基因在盾殼霉分生孢子的產(chǎn)生和萌發(fā)以及寄生核盤菌菌核方面起著重要作用。此外,通過亞細胞定位發(fā)現(xiàn)該基因定位于線粒體,敲除該基因?qū)е戮�粒體畸形、腫大、結(jié)構(gòu)松散。同時,細胞內(nèi)活性氧含量上升,ΔCmAim24在非發(fā)酵性碳源上的生長受到更大程度的抑制。菌株ZS-1TN5012是一株菌落顏色較淺、生長慢、分生孢子產(chǎn)生有缺陷的突變體。Southern blot證明ZS-1TN5012為T-DNA單拷貝插入突變體,通過hiTAIL-PCR技術(shù)克隆了突變菌株ZS-1TN5012中T-DNA所在位點左側(cè)的核苷酸序列。序列分析表明T-DNA插入破壞了一個全長為1170 bp的基因,該基因不包含內(nèi)含子,推定編碼389 aa的蛋白質(zhì)。將推定氨基酸序列進行同源性比較,發(fā)現(xiàn)該序列與其它物種的3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMGR)具有高度同源性,因此將該基因命名為CmHmgr。HMGR為甲羥戊酸生成通路的限速酶,他汀類藥物可以抑制其活性發(fā)揮。通過培養(yǎng)基中添加阿托伐他汀發(fā)現(xiàn),ZS-1也表現(xiàn)出突變體ZS-1TN5012一致的表型。此外,突變體ZS-1TN5012對該藥物的敏感性增加。通過亞細胞定位發(fā)現(xiàn),該基因定位在盾殼霉的線粒體,進一步通過基因敲除和互補技術(shù)表明,該基因影響盾殼霉孢子的形成及重寄生作用。綜上,本研究從盾殼霉中克隆到三個產(chǎn)孢相關(guān)基因CmVps39、CmAim24和CmHmgr。研究發(fā)現(xiàn),這三個基因都影響了盾殼霉分生孢子的產(chǎn)生和重寄生能力,說明盾殼霉分子孢子形成和寄生過程十分復雜,受到多種基因的調(diào)控。
[Abstract]:The results showed that CmVps39 could not only regulate vacuolar morphology but also maintain osmotic and pH balance . The results showed that CmVps39 could not only regulate vacuolar morphology but also maintain osmotic and pH balance . This gene was identified as CmHmgr.HMGR is a restriction enzyme which has a full length of 1170 bp . The gene does not contain intron , and it is a putative protein encoding 389 aa . The gene is cloned into three sporulation - related genes CmVps39 , CmAim24 and CmHgr.Through the addition of atorvastatin , the gene is cloned into three sporulation - related genes CmVps39 , CmAim24 and CmHgr.Through the subcell localization , the gene is cloned into three sporulation - related genes CmVps39 , CmAim24 and CmHgr.After the gene knockout and complementary techniques , the gene is cloned into three sporulation - related genes CmVps39 , CmAim24 and CmHgr.These three genes are very complex to the formation and parasitism of the conidium of the pelarmold .

【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S476

【參考文獻】

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本文編號：1757149