本文選題：骨肉瘤 + miRNA-34a��； 參考：《武漢大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：第一部分：基因T程方法制備的miR-34a前藥通過誘導(dǎo)凋亡與細(xì)胞周期捕獲抑制骨肉瘤生長背景：骨肉瘤是發(fā)生在兒童及青年的最常見的骨科惡性腫瘤,microRNA-34a(下文簡稱miR-34a)是一種基于微小RNA的新型抗癌藥物。我們最近開發(fā)了一種用來合成miR-34a前藥新的生物工程方法。實(shí)驗(yàn)第一部分的目的即為了評估所制備的miR-34a前藥在原位裸鼠骨肉瘤模型中的抑癌安全性及有效性。方法：在體外實(shí)驗(yàn)中,利用miR-34a轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞系,細(xì)胞的增殖活性采用MTT實(shí)驗(yàn)來評估；腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移能力采用細(xì)胞基質(zhì)侵襲小室實(shí)驗(yàn)來量化；細(xì)胞凋亡及各細(xì)胞周期細(xì)胞的分布情況均采用商業(yè)化試劑盒處理后流式細(xì)胞儀檢測；miR-34a作用于腫瘤細(xì)胞的靶靶蛋白表達(dá)采用western blot來檢測；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,我們采用骨肉瘤的原位種植模型來評估m(xù)iR-34a的體內(nèi)安全性及有效性,miR-34a先用商業(yè)化的in vivo-jetPEI(以后簡稱PEI)來混合均勻,再通過靜脈注射入負(fù)荷腫瘤的裸鼠,定期監(jiān)測腫瘤的大小,在實(shí)驗(yàn)的最后獲取裸鼠的血液并檢測血液肝功能、腎功能及相關(guān)生化指標(biāo)。結(jié)果：與對照組相比,miR-34a可以顯著地抑制骨肉瘤細(xì)胞系(143B與MG-63)在體外的生長情況,這種抑制作用存在明顯的量-效關(guān)系；在相應(yīng)的流式細(xì)胞儀檢測中,可以觀測到與細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象與細(xì)胞周期捕獲現(xiàn)象。進(jìn)一步western-blot實(shí)驗(yàn)表明,與細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期捕獲的相關(guān)miR-34a靶蛋白如SIRT1, BCL2, c-MET,和CDK6都相應(yīng)降低。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)過兩周,共6次經(jīng)尾靜脈給藥可顯著抑制骨肉瘤的生長,實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)的生化檢查也表明,治療劑量的miR-34a靜脈給藥不會帶來明顯的毒副反應(yīng)；結(jié)論：基因工程獲得的miR-34a前藥可抑制骨肉瘤生長,并且不會帶來明顯的全身毒副作用：可能機(jī)制為miR-34a可相對特異地誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期捕獲。第二部分：聯(lián)合應(yīng)用基因工程制得的miR-34a前藥與多柔比星可協(xié)同抑制骨肉瘤增長目的：第一部分結(jié)果表明,應(yīng)用基因工程方法制取的miR-34a在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中均能抑制骨肉瘤細(xì)胞或者瘤體的生長。在第二部分的實(shí)驗(yàn)中,我們我們主要來驗(yàn)證miR-34a在骨肉瘤的治療中是否與傳統(tǒng)化療藥物多柔比星存在協(xié)同作用；方法：在體外實(shí)驗(yàn)中,運(yùn)用Chou-Talalay方法設(shè)計(jì)miR-34a與多柔比星藥物聯(lián)用的多種組合模式,運(yùn)用MTT法測定聯(lián)合用藥后腫瘤細(xì)胞的增殖活性,原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Compusyn軟件并通過計(jì)算藥物聯(lián)用指數(shù)來了解兩種藥物是否存在協(xié)同作用；然后,利用細(xì)胞基質(zhì)侵襲小室實(shí)驗(yàn)來評估藥物對腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移能力的影響；細(xì)胞凋亡及各細(xì)胞周期細(xì)胞采用流式細(xì)胞儀檢測;利用Western-Blot技術(shù)檢測藥物相關(guān)靶點(diǎn)的表達(dá)改變；在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,首先建立骨肉瘤的原位種植模型,然后將miR-34a單獨(dú)或者與多柔比星聯(lián)合系統(tǒng)應(yīng)用于載瘤裸鼠,監(jiān)測腫瘤的生長,在實(shí)驗(yàn)的最后獲取動(dòng)物血液標(biāo)本進(jìn)行藥物安全性分析,并切取腫瘤標(biāo)本進(jìn)行病理學(xué)檢查。結(jié)果：結(jié)果顯示,miR-34a與多柔比星聯(lián)合應(yīng)用存在協(xié)同作用,這種協(xié)同作用在早期、同時(shí)給藥時(shí)達(dá)到最大；與單一用藥相比,二者聯(lián)合用藥都能更有效地抑制143B細(xì)胞細(xì)胞增殖抑制、細(xì)胞周期捕獲以及細(xì)胞侵襲等；與這些細(xì)胞活動(dòng)相對應(yīng)的miR-34a靶點(diǎn)SIRT1,c-MET,與CDK6也都相應(yīng)降低；在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,聯(lián)合應(yīng)用miR-34a及多柔比星時(shí)對腫瘤的抑制效果也明顯優(yōu)于單一用藥；在藥物安全性方面,經(jīng)過兩周的給藥,小鼠的肝功能及腎功能均未見明顯損害,體內(nèi)總體蛋白水平也沒有明顯降低；結(jié)論：上述結(jié)果表明,聯(lián)合應(yīng)用miR-34a及多柔比星在細(xì)胞及動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)均能達(dá)到一定的腫瘤抑制協(xié)同作用,在治療劑量下二者聯(lián)用不會產(chǎn)生明顯的毒副作用。
[Abstract]:The first part: the process method of T gene by miR-34a prodrug by inducing apoptosis and cell cycle arrest inhibited the growth of osteosarcoma background: osteosarcoma is occurring in children and youth of the most common malignant tumor in the Department of orthopedics, microRNA-34a (hereinafter referred to as miR-34a) is a new type of micro anticancer drugs based on RNA. We developed a used to synthesize miR-34a prodrugs of new biological engineering method recently. To the first part of the experiment is to evaluate the preparation before the miR-34a drug safety and efficacy of anti carcinoma in situ of osteosarcoma in nude mice model. Methods: in vitro, using human osteosarcoma cells miR-34a transfection, cell proliferation activity by MTT experimental evaluation; invasion and metastasis of tumor cells by stromal invasion assay was used to quantify; using commercial kits and the distribution of cell cycle and apoptosis After treatment by flow cytometry; expression of target protein in tumor cell miR-34a using Western blot to detect; in vivo, we used orthotopic osteosarcoma model to evaluate the safety and efficacy of miR-34a in vivo, miR-34a first commercial in vivo-jetPEI (later referred to as PEI) to mix evenly, then through the intravenous injection into the tumor load of nude mice, regular monitoring of tumor size, at the end of the experiment to obtain the blood and blood of nude mice liver function, renal function and related biochemical indicators. Results: compared with control group, miR-34a can significantly inhibit osteosarcoma cell lines (143B and MG-63) on the growth of in vitro. There was an obvious dose-response relationship in this inhibition; flow cytometry corresponding detection, apoptosis can be observed is consistent with the experimental results of cell proliferation and cell cycle arrest For that phenomenon. Further Western-blot experiment, and cell apoptosis and cell cycle arrest of miR-34a target proteins such as SIRT1, BCL2, c-MET, and CDK6 were all decreased. In animal experiments, after two weeks, a total of 6 times after intravenous injection can significantly inhibit the growth of osteosarcoma, biochemical examination at the end of the experiment it showed that the therapeutic dose of intravenous miR-34a has obvious side reactions to drugs not; conclusion: the recombinant miR-34a prodrug can inhibit the growth of osteosarcoma, and will not cause significant systemic toxicity: a possible mechanism for miR-34a can be relatively specific induced tumor cell apoptosis and cell cycle arrest in osteosarcoma. The second part: the combined application of gene engineering prepared miR-34a prodrug of doxorubicin can inhibit the growth of osteosarcoma Objective: in the first part, the results show that the preparation of application of gene engineering methods in vivo and miR-34a In vitro can inhibit osteosarcoma cells or tumor growth. In the second part of the experiment, we mainly to verify whether miR-34a in the treatment of osteosarcoma with traditional chemotherapy drug doxorubicin has a synergistic effect; methods: in vitro, using a variety of combination mode of miR-34a and the design of multi Chou-Talalay method epirubicin combined with other drugs, determination of proliferation activity of tumor cells after combination with MTT method, the original data into Compusyn software and through the calculation of drug use index to understand whether there is a synergistic effect of two kinds of drugs; then, using cell matrix invasion assay to evaluate the drug to the tumor invasion and metastasis; and the cell cycle cell apoptosis was detected by flow cytometry; using Western-Blot technology to detect the expression of drug target change; in vivo First of all, to establish orthotopic osteosarcoma, then miR-34a alone or combined with doxorubicin loaded system in nude mice, tumor growth was monitored, analysis of drug safety in the end of the experiment to obtain animal blood samples, and the tumor pathology. Results: the results showed that there are synergistic effect of miR-34a combined with doxorubicin, this synergistic effect in the early stage, and reached the maximum when administered; compared with monotherapy, the combination of the two drugs can effectively inhibit the proliferation of 143B cell inhibition, cell cycle arrest and cell invasion; miR-34a target SIRT1, corresponding to these cell activities c-MET and CDK6 are reduced; in vivo, combination of miR-34a and doxorubicin on tumor inhibition effect was significantly better than the single drug; the drug safety, the After two weeks of administration, liver function and renal function of mice showed no obvious damage, has not significantly reduced the overall protein levels in vivo; conclusion: These results show that the combination of miR-34a and doxorubicin in vitro and in vivo animal experiment can achieve some antitumor synergy, at therapeutic doses of two combined with no obvious side effects.

【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R738

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本文編號：1753864