本文選題：東方巴貝斯蟲 + TRAP2　； 參考：《華中農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：東方巴貝斯蟲(Babesia orientalis)是1984年新發(fā)現(xiàn)并證實(shí)的巴貝斯蟲新種,臨床研究表明其僅僅對(duì)水牛有較嚴(yán)重的致病性,并由鐮形扇頭蜱經(jīng)卵傳遞,主要分布在我國(guó)長(zhǎng)江以南的區(qū)域�；疾�(dòng)物臨床表現(xiàn)為貧血、高熱、黃疸和血紅蛋白尿等癥狀,嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致死亡,對(duì)我國(guó)南方農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和水牛養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重威脅。當(dāng)前,水牛巴貝斯蟲病的防治還是傳統(tǒng)的用藥物涂抹防治,治療效果很不理想,而臨床用于防控治療東方巴貝斯蟲病疫苗鮮有報(bào)道,對(duì)蟲體侵染宿主相關(guān)的關(guān)鍵分子研究也不系統(tǒng)�；诖�,本研究選取已經(jīng)在頂復(fù)門類原蟲中確定的關(guān)鍵入侵分子TRAP蛋白為研究對(duì)象,從現(xiàn)有的東方巴貝斯蟲基因庫里釣取了東方巴貝斯蟲凝血酶敏感素相關(guān)無名蛋白 2 (Babesia orientalis Thrombospondin-related anonymous protein2, BoTRAP2)基因信息并進(jìn)行克隆與分析,并探索了 BoTRAP2蛋白與水牛紅細(xì)胞膜蛋白的互作,BoTRAP2蛋白及其結(jié)構(gòu)域在與肝素的結(jié)合時(shí)的功能特點(diǎn),最后對(duì)BoTRAP2蛋白晶體的形成也進(jìn)行了嘗試。(1)東方巴貝斯蟲TRAP2基因的克隆、表達(dá)和生物信息學(xué)分析通過序列比對(duì)在東方巴貝斯蟲全基因庫中查找到了一段和牛巴貝斯蟲TRAP2基因序列(XM_001609762.1)同源性極高的序列。設(shè)計(jì)特異性的引物在東方巴貝斯蟲全基因庫中擴(kuò)增到一條2817bp的片段,對(duì)該核苷酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)其含有2段vWFA結(jié)構(gòu)域、2段TSP結(jié)構(gòu)域、1段MIADS結(jié)構(gòu)性域、1段橫跨膜結(jié)構(gòu)域,與典型的TRAP樣家族核苷酸結(jié)構(gòu)非常吻合,表明該基因序列為東方巴貝斯蟲TRAP2基因。同源性分析表明該氨基酸序列與牛巴貝斯蟲TRAP2氨基酸序列的同源性高達(dá)94%,生物信息學(xué)軟件分析表明該蛋白具有很好的抗原性。(2)東方巴貝斯蟲TRAP2蛋白和紅細(xì)胞膜蛋白的相互作用選取TRAP2蛋白的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域(含有vWFA、TSP、MIADS關(guān)鍵序列區(qū)域)進(jìn)行截短表達(dá),設(shè)計(jì)含有合適酶切位點(diǎn)特異性的引物克隆TRAP2-vWFA-TSP,構(gòu)建含單一 His標(biāo)簽的原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-TRAP2-vWFA-TSP,轉(zhuǎn)入BL21表達(dá)菌株中。經(jīng)過探索,在18℃、100rpm、IPTG濃度1.0mM、培養(yǎng)15h能得到高效表達(dá)在上清液的蛋白,通過鎳柱純化能獲得高純度的目的蛋白。Far-western驗(yàn)證重組TRAP2-vWFA-TSP蛋白與紅細(xì)胞膜蛋白的互作,結(jié)果顯示在紅細(xì)胞膜蛋白上有一條疑似目的條帶,表明東方巴貝斯蟲TRAP2蛋白與紅細(xì)胞膜表面的某一蛋白有一定的結(jié)合作用。(3)東方巴貝斯蟲TRAP2蛋白及其結(jié)構(gòu)域和肝素的粘附結(jié)合分別構(gòu)建 pET-28a-TRAP2-vWFA-TSP、pET-28a- TRAP2-vWFA、pET-28a-TRAP2-TSP原核表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)入BL21表達(dá)菌株中,經(jīng)過探索,獲得了大量高純度的重組 TRAP2-vWFA-TSP、TRAP2-vWFA、TRAP2-TSP 蛋白,通過 ELISA 驗(yàn)證TRAP2蛋白及其結(jié)構(gòu)域與肝素的相互作用。結(jié)果顯示TRAP2蛋白及其結(jié)構(gòu)域與肝素都有很好的結(jié)合,并且TRAP2-vWFA-TSP蛋白與肝素的結(jié)合親和力強(qiáng)于單獨(dú)的TRAP2-vWFA、TRAP2-TSP蛋白與肝素結(jié)合的親和力之和,這也表明了在TRAP2蛋白與肝素結(jié)合時(shí)其單個(gè)結(jié)構(gòu)域可能起著協(xié)同作用。(4)東方巴貝斯蟲TRAP2蛋白晶體的初篩將純化后的截短pET-28a-TRAP2-vWFA-TSP蛋白用型號(hào)為GE Superdx200pg分子篩純化柱再次純化,依據(jù)分子篩的運(yùn)行圖得知pET-28a-TRAP2-vWFA-TSP蛋白以二聚體復(fù)合物的形式存在,經(jīng)過分子篩純化濃縮后能得到蛋白濃度為9mg/mL、純度90%的目的蛋白,經(jīng)過商業(yè)化結(jié)晶板進(jìn)行初篩得到疑似蛋白晶體的小晶塊,通過改變Buffer緩沖液中的鹽離子、沉淀劑的濃度來進(jìn)行優(yōu)化,實(shí)驗(yàn)未得到理想的結(jié)果,需要進(jìn)一步摸索條件。本課題成功克隆了東方巴貝斯蟲的TRAP2基因并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了 BoTRAP2基因的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域,驗(yàn)證了 BoTRAP2蛋白抗原性及BoTRAP2蛋白與紅細(xì)胞膜蛋白的互作,證實(shí)了 TRAP2蛋白及其結(jié)構(gòu)域蛋白與肝素存在的特異性結(jié)合。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,對(duì)深入探討巴貝斯蟲入侵宿主的分子機(jī)制及對(duì)巴貝斯蟲病的免疫預(yù)防研究具有重要意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S852.723

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1753747