本文選題：結(jié)核病　切入點(diǎn)：朊蛋白疾病　出處：《揚(yáng)州大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：結(jié)核病是由結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的一類危害嚴(yán)重的人畜共患病。結(jié)核病的傳播和流行對世界農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展、公共衛(wèi)生健康有著嚴(yán)重的影響。小鼠SP110基因是一種能調(diào)節(jié)結(jié)核病先天免疫力的基因—也稱Ipr1基因(intracellular pathogenresistance 1)。大量研究結(jié)果顯示小鼠SP110基因可有效抑制結(jié)核桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的繁殖,并且能夠控制巨噬細(xì)胞的死亡方式。羊搔癢癥是朊蛋白類疾病(prion diseases)中的一種,由變異的阮蛋白(PrP)引發(fā),具有傳染性與不可治愈性。敲除動物內(nèi)源性的朊蛋白可抵抗朊病毒的感染,使動物具有抗病性。TALENs靶向基因敲除(敲入)技術(shù)是一種較新的分子生物學(xué)工具,能夠?qū)又参锛?xì)胞的基因組進(jìn)行高效和特異性修飾。本實(shí)驗(yàn)旨在通過TALENs基因打靶技術(shù)在山羊基因組上朊蛋白基因(PRNP)位點(diǎn)定點(diǎn)插入SP110基因,生產(chǎn)既抗結(jié)核病又抗羊瘙癢癥的雙抗轉(zhuǎn)基因山羊。主要內(nèi)容有以下幾個方面:1 SP110基因在羊巨噬細(xì)胞中的功能驗(yàn)證。構(gòu)建以巨噬細(xì)胞特異性啟動子調(diào)控SP110表達(dá)的真核表達(dá)載體pGH-SP110,同時設(shè)pCDNA3-SP110載體及pCDNA3空載體為對照,將其轉(zhuǎn)染羊肺泡巨噬細(xì)胞,并進(jìn)行體外攻菌試驗(yàn),荷菌數(shù)計數(shù)分析攻菌后巨噬細(xì)胞內(nèi)恥垢分枝桿菌的數(shù)量,結(jié)果表明轉(zhuǎn)染pGH-SP110真核表達(dá)載體的羊肺泡巨噬細(xì)胞裂解后釋放的活菌數(shù)顯著低于pCDNA3空載體對照組,說明SP110具有增強(qiáng)巨噬細(xì)胞抵抗恥垢分枝桿菌生長和增殖的能力。2.TALENs表達(dá)載體的構(gòu)建與活性鑒定。針對羊13號染色體的PRNP基因位點(diǎn)設(shè)計6組特異性的TALENs,構(gòu)建了 6組表達(dá)載體并將其分別轉(zhuǎn)染羊成纖維細(xì)胞以檢驗(yàn)其切割活性。利用PCR擴(kuò)增細(xì)胞基因組中TALENs靶位點(diǎn)附近序列,通過T7E1核酸內(nèi)切酶鑒定、BamHⅠ酶切鑒定及TA克隆測序分析6組TALENs載體的基因突變功能,結(jié)果表明所設(shè)計的6組TALENs中,TALEN-L4/R1的切割活性最高,約為35%。3.靶向 PRNP基因位點(diǎn)的MSR-SP110同源重組載體構(gòu)建及定位整合細(xì)胞株的獲得。針對羊13號染色體的PRNP位點(diǎn)設(shè)計MSR-SP110打靶載體,PCR分別擴(kuò)增出PRNP基因第三外顯子上的5'同源臂序列和3'同源臂序列,并以Puromycin為正篩選基因,DTA為負(fù)篩選基因,構(gòu)建打靶載體pT-SP110。然后將打靶載體pT-SP110與TALEN-L4/R1共轉(zhuǎn)染30日齡原代山羊胎兒成纖維細(xì)胞,經(jīng)藥物篩選共獲得102個抗性細(xì)胞克隆,通過兩輪PCR對其進(jìn)行基因型鑒定,結(jié)果獲得了 5個發(fā)生同源重組細(xì)胞克隆,該位點(diǎn)打靶效率為4.9%。4.體細(xì)胞核移植制備克隆羊及其初步分析。以78號定位重組細(xì)胞為核供體進(jìn)行核移植,獲得2只懷孕羊。手術(shù)分離1只懷孕65d的克隆胎兒用于分析,基因型檢測結(jié)果顯示其PRNP基因位點(diǎn)發(fā)生了同源重組(定位敲入SP110基因);RT-PCR檢測結(jié)果顯示該克隆羊朊蛋白基因轉(zhuǎn)錄下調(diào)、Westem blot檢測結(jié)果顯示該克隆羊內(nèi)源性阮蛋白表達(dá)顯著減少,預(yù)期可降低對羊瘙癢病的易感性;同時,定位插入的MSR-SP110預(yù)期可啟動巨噬細(xì)胞特異性SP110基因表達(dá),增強(qiáng)巨噬細(xì)胞抗菌功能。結(jié)論:本研究通過同源重組,在羊PRNP基因位點(diǎn)定位插入了 MSR-SP110表達(dá)框,同時敲除了一個PRNP等位基因、降低朊蛋白表達(dá),可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對病菌的抵抗力。本研究將會獲得既抗結(jié)核病,又抗瘙癢癥的轉(zhuǎn)基因羊。研究成果不僅對結(jié)核病及朊蛋白類疾病的預(yù)防與控制有重大意義,也為動物抗病育種和疾病模型研制提供了新思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S858.27;Q78

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