本文選題：結(jié)核病　切入點：朊蛋白疾病　出處：《揚州大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：結(jié)核病是由結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的一類危害嚴重的人畜共患病。結(jié)核病的傳播和流行對世界農(nóng)業(yè)經(jīng)濟發(fā)展、公共衛(wèi)生健康有著嚴重的影響。小鼠SP110基因是一種能調(diào)節(jié)結(jié)核病先天免疫力的基因—也稱Ipr1基因(intracellular pathogenresistance 1)。大量研究結(jié)果顯示小鼠SP110基因可有效抑制結(jié)核桿菌在巨噬細胞內(nèi)的繁殖,并且能夠控制巨噬細胞的死亡方式。羊搔癢癥是朊蛋白類疾病(prion diseases)中的一種,由變異的阮蛋白(PrP)引發(fā),具有傳染性與不可治愈性。敲除動物內(nèi)源性的朊蛋白可抵抗朊病毒的感染,使動物具有抗病性。TALENs靶向基因敲除(敲入)技術(shù)是一種較新的分子生物學(xué)工具,能夠?qū)又参锛毎幕蚪M進行高效和特異性修飾。本實驗旨在通過TALENs基因打靶技術(shù)在山羊基因組上朊蛋白基因(PRNP)位點定點插入SP110基因,生產(chǎn)既抗結(jié)核病又抗羊瘙癢癥的雙抗轉(zhuǎn)基因山羊。主要內(nèi)容有以下幾個方面:1 SP110基因在羊巨噬細胞中的功能驗證。構(gòu)建以巨噬細胞特異性啟動子調(diào)控SP110表達的真核表達載體pGH-SP110,同時設(shè)pCDNA3-SP110載體及pCDNA3空載體為對照,將其轉(zhuǎn)染羊肺泡巨噬細胞,并進行體外攻菌試驗,荷菌數(shù)計數(shù)分析攻菌后巨噬細胞內(nèi)恥垢分枝桿菌的數(shù)量,結(jié)果表明轉(zhuǎn)染pGH-SP110真核表達載體的羊肺泡巨噬細胞裂解后釋放的活菌數(shù)顯著低于pCDNA3空載體對照組,說明SP110具有增強巨噬細胞抵抗恥垢分枝桿菌生長和增殖的能力。2.TALENs表達載體的構(gòu)建與活性鑒定。針對羊13號染色體的PRNP基因位點設(shè)計6組特異性的TALENs,構(gòu)建了 6組表達載體并將其分別轉(zhuǎn)染羊成纖維細胞以檢驗其切割活性。利用PCR擴增細胞基因組中TALENs靶位點附近序列,通過T7E1核酸內(nèi)切酶鑒定、BamHⅠ酶切鑒定及TA克隆測序分析6組TALENs載體的基因突變功能,結(jié)果表明所設(shè)計的6組TALENs中,TALEN-L4/R1的切割活性最高,約為35%。3.靶向 PRNP基因位點的MSR-SP110同源重組載體構(gòu)建及定位整合細胞株的獲得。針對羊13號染色體的PRNP位點設(shè)計MSR-SP110打靶載體,PCR分別擴增出PRNP基因第三外顯子上的5'同源臂序列和3'同源臂序列,并以Puromycin為正篩選基因,DTA為負篩選基因,構(gòu)建打靶載體pT-SP110。然后將打靶載體pT-SP110與TALEN-L4/R1共轉(zhuǎn)染30日齡原代山羊胎兒成纖維細胞,經(jīng)藥物篩選共獲得102個抗性細胞克隆,通過兩輪PCR對其進行基因型鑒定,結(jié)果獲得了 5個發(fā)生同源重組細胞克隆,該位點打靶效率為4.9%。4.體細胞核移植制備克隆羊及其初步分析。以78號定位重組細胞為核供體進行核移植,獲得2只懷孕羊。手術(shù)分離1只懷孕65d的克隆胎兒用于分析,基因型檢測結(jié)果顯示其PRNP基因位點發(fā)生了同源重組(定位敲入SP110基因);RT-PCR檢測結(jié)果顯示該克隆羊朊蛋白基因轉(zhuǎn)錄下調(diào)、Westem blot檢測結(jié)果顯示該克隆羊內(nèi)源性阮蛋白表達顯著減少,預(yù)期可降低對羊瘙癢病的易感性;同時,定位插入的MSR-SP110預(yù)期可啟動巨噬細胞特異性SP110基因表達,增強巨噬細胞抗菌功能。結(jié)論:本研究通過同源重組,在羊PRNP基因位點定位插入了 MSR-SP110表達框,同時敲除了一個PRNP等位基因、降低朊蛋白表達,可增強巨噬細胞對病菌的抵抗力。本研究將會獲得既抗結(jié)核病,又抗瘙癢癥的轉(zhuǎn)基因羊。研究成果不僅對結(jié)核病及朊蛋白類疾病的預(yù)防與控制有重大意義,也為動物抗病育種和疾病模型研制提供了新思路。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S858.27;Q78

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 馮政;梅書棋;劉貴生;武華玉;彭先文;李良華;;畜禽基因定位方法及研究[J];畜禽業(yè);2009年08期

2 李申德,張思仲;人類基因定位[J];遺傳學(xué)報;1980年01期

3 李奎;;豬基因定位研究進展與應(yīng)用潛力[J];國外畜牧科技;1992年04期

4 辛志勇;小麥基因定位的最新資料[J];作物雜志;1985年02期

5 張繼全;畜禽基因定位的研究進展[J];國外畜牧科技;1995年01期

6 雍茂龍,徐順來;豬的基因定位與轉(zhuǎn)移[J];四川畜牧獸醫(yī);1996年04期

7 賈青;畜禽基因定位的現(xiàn)狀和展望[J];黃牛雜志;1997年02期

8 孫梅,劉紅林;原位雜交技術(shù)及其在動物基因定位上的應(yīng)用進展[J];黃牛雜志;2000年06期

9 張素梅;蔣玉寶;劉保申;;分子標記技術(shù)在玉米基因定位上的研究進展[J];生物技術(shù);2006年06期

10 杜生明;林木抗病基因定位研究現(xiàn)狀及策略[J];遺傳;1998年05期

相關(guān)會議論文 前10條

1 張啟軍;廖慧敏;秦海龍;夏士健;宗壽余;呂川根;嚴文貴;;一個秈稻葉夾角新基因的激素敏感性分析與基因定位[A];中國遺傳學(xué)會第九次全國會員代表大會暨學(xué)術(shù)研討會論文摘要匯編（2009-2013）[C];2013年

2 王妍;鄭文靜;劉志恒;何瑞s，

本文編號：1719954