本文選題：卵巢癌　切入點(diǎn)：p53　出處：《鄭州大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景卵巢癌因其早期癥狀不明顯、不易發(fā)現(xiàn),造成臨床上發(fā)現(xiàn)時(shí)多為中晚期,并且在化療過程中一線化療藥物紫杉醇聯(lián)合卡鉑產(chǎn)生的繼發(fā)耐藥時(shí)常發(fā)生,使得卵巢癌患者的5年生存期較短。在一線化療藥物耐藥的情況下,如何有效的預(yù)測、減少耐藥增敏化療敏感性成為亟待解決的問題。如何精準(zhǔn)的判斷個(gè)體對一線化療藥物的原發(fā)和繼發(fā)耐藥性,為不同的患者提供個(gè)性化的治療方案,增加化療的敏感性,提高治療的有效性,研究人員進(jìn)行了大量的工作。上皮性卵巢癌在卵巢癌中占比超過50%,但由于上皮性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因參與、多因素作用并經(jīng)過較長時(shí)間形成的復(fù)雜的過程,因此,目前的研究成果并沒有形成很好的理論去闡釋卵巢癌的發(fā)病、發(fā)展和耐藥現(xiàn)象。在研究中,越來越多的證據(jù)表明,細(xì)胞凋亡的改變與鉑類藥物耐藥密切相關(guān)。而在細(xì)胞凋亡過程中,p53和線粒體起著重要的作用�，F(xiàn)有大量的研究表明p53基因改變與鉑類藥物耐藥密切相關(guān),線粒體是p53調(diào)控對象和細(xì)胞中能量代謝的重要參與者,D-loop區(qū)是線粒體最易發(fā)生突變的區(qū)域,但是將p53和線粒體D-loop區(qū)的基因突變與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展、耐藥、藥物增敏及預(yù)后之間關(guān)系的研究仍較少。本研究擬對p53基因和線粒體基因組中的D-loop區(qū)基因多態(tài)性與上皮性卵巢癌發(fā)生、發(fā)展、耐藥、藥物增敏及預(yù)后之間關(guān)系進(jìn)行研究。在上皮性卵巢癌化療增敏藥物的選擇上,雖然許多輔助增強(qiáng)化療效果的藥物被發(fā)現(xiàn),但是大多臨床效果仍待時(shí)間檢驗(yàn)。本研究選取了雖然對卵巢癌化療增敏效果有爭議但在臨床上安全使用20余年的廉價(jià)、安全藥物二甲雙胍作為增敏劑進(jìn)行研究。許多回顧性研究和體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),二甲雙胍對乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌等腫瘤細(xì)胞株的細(xì)胞生長有抑制,但到臨床統(tǒng)計(jì)中也有學(xué)者得出截然相反的結(jié)論。這種情況的出現(xiàn)可能與標(biāo)本的納入標(biāo)準(zhǔn)及數(shù)量有關(guān),也可能與人種、地域差異、細(xì)胞株的選擇有關(guān)。因此,有必要針對不同地域、不同的個(gè)體在細(xì)胞水平上研究二甲雙胍是否可以起到對上皮性卵巢癌化療的增敏作用,為臨床提供理論依據(jù)。在實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)中,考慮卵巢特別是癌變卵巢組織往往取樣困難,且?guī)缀醪豢赡茉隗w內(nèi)二次重復(fù)取樣;因此,先利用醫(yī)院保存的上皮性卵巢癌和非癌患者卵巢組織標(biāo)本石蠟包埋切片作為研究對象,通過擴(kuò)增、測序的方法對P53和線粒體D-loop區(qū)基因多態(tài)性和突變進(jìn)行分析;在此基礎(chǔ)上收集臨床病患中上皮性卵巢癌和非癌患者卵巢組織、組織石蠟包埋切片、病患外周血中游離DNA,研究三者中P53和線粒體D-loop區(qū)基因多態(tài)性差異。在實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)中,考慮到常規(guī)研究中常常采用各種商品化細(xì)胞株,其生物學(xué)特性與在體內(nèi)的原代細(xì)胞相比發(fā)生了較大的變化;因此,本研究將收集到的新鮮組織進(jìn)行原代培養(yǎng)及有限傳代并進(jìn)行人工耐藥馴化,觀察不同基因突變耐藥情況,以期有助于提高臨床上對上皮性卵巢癌患者個(gè)性化治療和預(yù)后評估。利用第三代傳代細(xì)胞進(jìn)行二甲雙胍化療增敏效果與p53、線粒體基因突變關(guān)系的研究。并在此基礎(chǔ)上,采用第三代傳代細(xì)胞注釋裸鼠建立移植瘤,觀察二甲雙胍對不同個(gè)體來源移植瘤的影響,為進(jìn)一步了解P53和線粒體D-loop區(qū)基因多態(tài)性與上皮性卵巢癌發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后的關(guān)系提供新的理論依據(jù),為二甲雙胍在不同基因多態(tài)性上皮性卵巢癌病患中應(yīng)用提供參考。第一部分p53、線粒體DNA多態(tài)性與卵巢癌的關(guān)系目的通過對醫(yī)院臨床資料完整明確的河南地區(qū)非癌患者卵巢組織和上皮性卵巢癌病人癌變的卵巢組織中p53、D-loop DNA的突變和多態(tài)性進(jìn)行比較,依據(jù)測序結(jié)果結(jié)合臨床上繼發(fā)耐藥情況,研究河南地區(qū)人群中p53、D-loop的多態(tài)性、突變和上皮性卵巢癌發(fā)生、耐藥的關(guān)系,獲得潛在的上皮性卵巢癌檢測指標(biāo)和易耐藥檢測指標(biāo)。通過對病患外周血、傳代細(xì)胞、卵巢組織及切片中p53、線粒體基因差異研究,探討外周血中游離DNA檢測卵巢癌及評估耐藥性的可能,并對組織切片與實(shí)際新鮮組織多態(tài)性的差異比較,為臨床和后續(xù)試驗(yàn)提供依據(jù)和借鑒。方法1.卵巢組織切片中p53、線粒體基因的差異研究選取鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院(以下簡稱“鄭大一附院”)和濮陽市人民醫(yī)院收治的在河南生活超過二十年的病患卵巢組織切片作為研究對象。其中60份上皮性卵巢癌組織石蠟標(biāo)本為首次腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)中收集到的,對照組61例卵巢癌陰性標(biāo)本為非癌患者卵巢癌組織切片。1.1選取相同厚度的石蠟切片并稱量,獲取等量石蠟包埋卵巢組織。對這些組織切片中的DNA進(jìn)行提取、鑒定,比較石蠟包埋組織存放時(shí)間對其中DNA提取的質(zhì)和量的影響。1.2為實(shí)現(xiàn)大規(guī)模PCR鑒定、測序需要,將傳統(tǒng)的PCR條件優(yōu)化、擴(kuò)增、鑒定、回收等實(shí)驗(yàn)流程優(yōu)化為以熒光染料進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測的熒光定量PCR,減少操作步驟,避免出錯(cuò)和污染。1.3利用DNAMAN軟件將上皮性卵巢癌組織的PCR產(chǎn)物序列、非癌患者卵巢組織標(biāo)本的PCR產(chǎn)物序列進(jìn)行比對,如果上皮性卵巢癌組織與非癌患者卵巢組織中的核苷酸序列均為多樣化,則為多態(tài)性;如果僅表現(xiàn)為上皮性卵巢癌組織的核苷酸序列與非癌患者組織標(biāo)本不一致,則為突變。2.外周血、傳代細(xì)胞、卵巢組織及切片中p53、線粒體基因差異研究2.1原代培養(yǎng)與傳代:采用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞,隨后用0.3%膠原蛋白酶或聯(lián)合胰酶在37℃的水浴中反應(yīng)15min-30min,然后用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并加入細(xì)胞瓶中。利用成纖維細(xì)胞能迅速貼壁的特點(diǎn),通過體外培養(yǎng)貼壁時(shí)間的差別將組織中的上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞進(jìn)行分離。選取適用于上皮細(xì)胞培養(yǎng)的低血清培養(yǎng)M199(SLM)作為后續(xù)培養(yǎng)的培養(yǎng)基,并在培養(yǎng)基中添加卵巢上皮細(xì)胞促生長因子和防止細(xì)菌生長的青鏈霉素雙抗。在細(xì)胞長至鋪滿底部70%左右時(shí)用膠原蛋白酶消化并進(jìn)行傳代。2.2基因多態(tài)性研究:將患者對外周血、第三代卵巢上皮細(xì)胞、新鮮卵巢組織及組織切片四組樣本分別提取DNA,采用染料法熒光定量PCR擴(kuò)增擴(kuò)增并鑒定后送上海生工測序,測序結(jié)果用DNAMAN軟件比對。2.2.1通過上皮性卵巢癌患者與非癌患者術(shù)前外周血游離DNA的對比,研究外周血游離DNA與上皮性卵巢癌的關(guān)系。2.2.2通過比較每個(gè)患者的外周血游離DNA、新鮮卵巢組織及卵巢組織切片中基因多態(tài)性的差異,研究外周血游離DNA檢測代替組織切片檢測的可能性以及評估兩者和人體卵巢組織基因多態(tài)性、檢測靈敏度的差異。2.2.3通過對第三代傳代細(xì)胞和原組織細(xì)胞基因多態(tài)性的比較,了解細(xì)胞傳代至第三代時(shí)相關(guān)基因位點(diǎn)的變化情況。結(jié)果1.卵巢組織切片中p53、線粒體基因的差異對121份臨床卵巢組織切片進(jìn)行DNA提取,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)合熔解曲線來優(yōu)化并監(jiān)控p53和D-loop區(qū)基因的PCR。1.1所提取DNA OD260/OD280大都在1.7-2.0之間,且提取量隨石蠟包埋組織存放時(shí)間的增加而減少。非癌患者組織切片中DNA含量和腫瘤患者組織切片中DNA含量無明顯差別。1.2經(jīng)過多輪的實(shí)驗(yàn)優(yōu)化、驗(yàn)證,確定了p53基因和線粒體DNA的D-loop區(qū)基因不同片段在20μL熒光定量PCR體系中擴(kuò)增的最佳條件。1.3通過測序發(fā)現(xiàn),與非癌患者卵巢p53基因相比,p53基因發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)9個(gè),多態(tài)性位點(diǎn)127個(gè)。與非癌患者卵巢D-loop基因相比,D-loop區(qū)基因發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)11個(gè),多態(tài)性位點(diǎn)165個(gè)。p53的7號外顯子44位密碼子由C突變?yōu)锳可檢出陽性標(biāo)本中的41份,檢出率為68.3%;D-loop區(qū)73位密碼子由A突變?yōu)镚可檢出陽性標(biāo)本52例,檢出率為86.7%,兩者聯(lián)合檢測可實(shí)現(xiàn)對60份陽性標(biāo)本的全檢出。對于60例上皮性卵巢癌患者中治療后1年內(nèi)復(fù)發(fā)的患者標(biāo)本進(jìn)行序列對比、統(tǒng)計(jì)、分析,結(jié)果顯示將Exon4-72G和D-loop309T作為復(fù)發(fā)標(biāo)本檢測指標(biāo)進(jìn)行檢測的話,檢出率為17/21。如果將Exon6-198G、Exon8-67A、D-loop309T、D-loop446A聯(lián)合檢測,復(fù)發(fā)標(biāo)本檢出率21/21,但非復(fù)發(fā)標(biāo)本有5份判為陽性。2.外周血、傳代細(xì)胞、卵巢組織及組織切片中p53、線粒體基因差異2.1非癌患者細(xì)胞第一代細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶底部70%面積平均用時(shí)21天,腫瘤細(xì)胞平均用時(shí)18天。從第二代傳至第三代時(shí),非癌患者卵巢細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底部70%面積平均用時(shí)15天,腫瘤細(xì)胞平均用時(shí)12天。采用DAB染色對上述第三代細(xì)胞進(jìn)行了上皮細(xì)胞特有表面抗原CK19鑒定,結(jié)果顯示均為陽性。30例卵巢癌患者中17例卵巢上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)成功并傳至第五代,15例非癌患者卵巢細(xì)胞成功培養(yǎng)7例并傳至第五代。2.2結(jié)果顯示:2.2.1非癌患者術(shù)前外周血游離DNA含量為7.7±2.6ng/mL,在17份卵巢癌中,2例I期患者含量為26.7±5.4ng/mL;6例II期患者為151±29ng/mL;9例III到IV期患者為234±32ng/mL。上皮性卵巢癌患者外周血中游離DNA含量較非癌患者升高明顯。2.2.2新鮮卵巢組織及其石蠟包埋切片對p53基因、D-loop區(qū)基因突變位點(diǎn)和多態(tài)性位點(diǎn)檢測效率一致。外周血中游離DNA檢出效率稍差,與前兩者相比,有4個(gè)p53基因多態(tài)性位點(diǎn)、2個(gè)D-loop區(qū)突變位點(diǎn)及11個(gè)D-loop區(qū)多態(tài)性位點(diǎn)未被檢測。但對于p53的7號外顯子44位密碼子由C突變?yōu)锳和D-loop區(qū)73位密碼子由A突變?yōu)镚兩者聯(lián)合檢測,仍可實(shí)現(xiàn)對17份陽性標(biāo)本的全檢出。顯示出p53的7號外顯子44位密碼子由C突變?yōu)锳和D-loop區(qū)73位密碼子由A突變?yōu)镚兩者聯(lián)合作為外周血游離DNA檢測卵巢癌的潛在可能。2.2.3第三代細(xì)胞較原卵巢組織新增p53基因突變位點(diǎn)2個(gè),多態(tài)性位點(diǎn)11個(gè),新增D-loop區(qū)基因多態(tài)性位點(diǎn)4個(gè),提示傳代造成了基因的改變。但發(fā)現(xiàn)的潛在的上皮性卵巢癌p53基因、線粒體D-loop區(qū)基因多態(tài)性檢測指標(biāo)和易耐藥復(fù)發(fā)的檢測指標(biāo)位點(diǎn)未發(fā)生改變,可作為后續(xù)細(xì)胞水平研究的檢測指標(biāo)。結(jié)論選取臨床確診的90例上皮性卵巢癌患者和76例非癌患者的卵巢組織標(biāo)本作為研究對象,通過對其p53基因、線粒體D-loop區(qū)基因的測序,發(fā)現(xiàn)了潛在的上皮性卵巢癌p53基因、線粒體D-loop區(qū)基因多態(tài)性檢測指標(biāo)和易耐藥復(fù)發(fā)的檢測指標(biāo)。對其中的45例病患的卵巢組織、組織切片、外周血及傳代卵巢上皮細(xì)胞標(biāo)本顯示進(jìn)行進(jìn)一步研發(fā),發(fā)現(xiàn)上皮性卵巢癌患者外周血中游離DNA含量較非癌患者升高明顯,石蠟包埋切片和外周血中游離DNA可替代新鮮卵巢組織作為基因多態(tài)性檢測對象。傳代雖然會造成基因的多態(tài)性變化,但發(fā)現(xiàn)的潛在的上皮性卵巢癌p53基因、線粒體D-loop區(qū)基因多態(tài)性檢測指標(biāo)和易耐藥復(fù)發(fā)的檢測指標(biāo)位點(diǎn)未發(fā)生改變,可作為后續(xù)細(xì)胞水平研究的檢測指標(biāo)。第二部分p53、線粒體基因多態(tài)性與二甲雙胍在卵巢癌化療中增敏關(guān)系目的利用卵巢細(xì)胞體外傳代第三代細(xì)胞進(jìn)行耐藥馴化,模擬多次化療耐藥的現(xiàn)象,進(jìn)而觀察二甲雙胍在紫杉醇、卡鉑治療中的增敏作用。通過檢測p53、D-loop基因多態(tài)性,研究p53、D-loop基因多態(tài)性與卵巢癌耐藥、二甲雙胍增敏的關(guān)系。在動物模型中也采用患者卵巢組織細(xì)胞傳代第三代細(xì)胞建模,并采用非癌患者體血藥濃度用藥,模擬人在正常用藥下二甲雙胍對化療的增敏作用,觀察p53、D-loop基因多態(tài)性對增敏效果的影響。方法1.二甲雙胍在傳代卵巢癌細(xì)胞中的增敏作用選第一部分第二章成功傳代5次的17株癌變卵巢組織的第三代傳代細(xì)胞作為研究對象,并用SKOV3細(xì)胞株作為陽性對照。將每株細(xì)胞在稀釋為5×105/mL和1×105/mL兩個(gè)濃度在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上各鋪48孔。5×105/mL的48孔細(xì)胞進(jìn)行耐藥馴化,1×105/mL作為未馴化對照。耐藥馴化采用短時(shí)間間歇式馴化,并按照耐藥馴化所用紫杉醇(0、0.6、1.2μg/mL)、卡鉑(0、10、25μg/mL)、二甲雙胍(0、0.5、2.5μg/mL)不同水平的組合采用三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)的方法分為9個(gè)組別。在三次馴化后,仍按正交實(shí)驗(yàn)組別分別加入馴化時(shí)所用藥物并培養(yǎng)72h,通過CCK8顯色觀察對實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的抑制率,研究二甲雙胍在卵巢癌不同化療中的增敏作用。2.二甲雙胍在卵巢癌細(xì)胞裸鼠移植瘤中的增敏作用用第一部分第二章成功傳代5次的17例癌變卵巢組織的第三代傳代細(xì)胞懸液接種于裸鼠皮下,構(gòu)建卵巢癌裸鼠移植瘤,比較卡鉑、紫杉醇聯(lián)合用藥與二甲雙胍、卡鉑、紫杉醇聯(lián)合用藥效果的差別。以移植瘤直徑不小于6mm為建模成功的標(biāo)準(zhǔn),將各株細(xì)胞中建模成功的裸鼠分別隨機(jī)分為五組:第一組采用生理鹽水作為對照;第二組作為低劑量組:二甲雙胍400μg/只、紫杉醇80μg/只、卡鉑200μg/只;第三組為高劑量組:二甲雙胍400μg/只、紫杉醇400μg/只、卡鉑1000μg/只;第四組為低劑量對照組:紫杉醇80μg/只、卡鉑200μg/只;第五組為高劑量對照組:紫杉醇400μg/只、卡鉑1000μg/只。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)對小鼠進(jìn)行解剖,根據(jù)對照組和實(shí)驗(yàn)組移植瘤體積的大小比值進(jìn)行抑制率計(jì)算。結(jié)果:1.二甲雙胍在不同傳代卵巢癌細(xì)胞中的增敏作用1.1對17株細(xì)胞進(jìn)行耐藥馴化,二甲雙胍具有明顯增敏作用的細(xì)胞12株。這12株細(xì)胞中9株有化療耐藥傾向。1.2利用Exon6-198G+Exon8-67A+D-loop309T+D-loop446A可在12株增敏作用的細(xì)胞中檢測出11株,檢出率為11/12。利用Exon4-72G+D-loop309T可在12株增敏作用的細(xì)胞中檢測出8株,均為耐藥株,耐藥菌株檢測率8/9。1.3二甲雙胍單獨(dú)使用,17株腫瘤細(xì)胞和7株非癌患者細(xì)胞均在72h出現(xiàn)2.72-3.56%不等的抑制,在120h出現(xiàn)3.24-6.83%不等的抑制。二甲雙胍對細(xì)胞的抑制存在時(shí)間依賴,但不隨二甲雙胍的量改變,提示在這兩個(gè)人體濃度值范圍內(nèi),二甲雙胍對細(xì)胞的抑制效果一致,但長期服用二甲雙胍效果會好些。2.二甲雙胍在卵巢癌細(xì)胞裸鼠移植瘤中的增敏作用17株細(xì)胞建模成功13株,最終成瘤大小和數(shù)量符合實(shí)驗(yàn)要求的9株。裸鼠實(shí)驗(yàn)表明,9組中包含細(xì)胞培養(yǎng)易耐藥細(xì)胞5個(gè)(S9、S27、S29、S1、S17),其中4個(gè)(S27、S29、S1、S17)對鉑類有耐藥傾向,2個(gè)(S9、S27)對紫杉醇有耐藥傾向,1個(gè)(S9)鉑類、紫杉醇聯(lián)合耐藥傾向),紫杉醇、卡鉑敏感細(xì)胞4個(gè)。對于紫杉醇、卡鉑聯(lián)合用藥量高低進(jìn)行比較,無論是否耐藥,均存在明顯的劑量正相關(guān)性。對于各劑量組中添加二甲雙胍的對照來看,S11、S6、S19、S26四株對紫杉醇、卡鉑敏感細(xì)胞中S19、S26表現(xiàn)出對二甲雙胍不敏感。其他細(xì)胞株的裸鼠實(shí)驗(yàn)表明,低劑量的紫杉醇、卡鉑在加入口服二甲雙胍后對其細(xì)胞抑制率增高明顯。與細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。結(jié)論二甲雙胍對卵巢癌耐藥細(xì)胞具有一定的逆轉(zhuǎn)耐藥作用,p53的E7-44A和D-loop區(qū)73G兩者聯(lián)合檢測出的卵巢癌陽性細(xì)胞中具有Exon4-72G、D-loop309T的多態(tài)性的容易復(fù)發(fā),且對二甲雙胍更為敏感,對于Exon6-198G、Exon8-67A、D-loop309T、D-loop446A基因型的卵巢癌細(xì)胞可使用二甲雙胍進(jìn)行增敏。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.31

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1719801