本文選題：黃稈烏哺雞竹　切入點：稈色變異　出處：《浙江農(nóng)林大學》2017年碩士論文

【摘要】：黃稈烏哺雞竹(Phyllostachys vivax f.aureocaulis)是竹亞科(Bambusoideae Nees)烏哺雞竹(Phyllostachys vivax McClure)的變型,竹稈為黃色,節(jié)間會出現(xiàn)不同寬度和深淺的綠色條紋,也有全綠稈和全黃稈的表型。本課題組利用抑制差減雜交技術(shù)構(gòu)建了全黃稈和全綠稈筍差異表達基因的SSH文庫,鑒定了光系統(tǒng)Ⅰ(PSⅠ)中PvLhca1和PvLhca2基因,實時定量RT-PCR分析表明,兩個基因在黃稈烏哺雞竹稈色變異過程中表達量變化顯著。為了探究PvLhca1和PvLhca2基因與黃稈烏哺雞竹稈色變異之間的關(guān)系,本課題首先克隆了黃稈烏哺雞竹PvLhca1和PvLhca2基因cDNA全長序列,通過實時定量RT-PCR技術(shù)檢測不同發(fā)育階段和不同呈色程度下PvLhca1和PvLhca2基因的表達模式,通過構(gòu)建植物過表達載體,轉(zhuǎn)化擬南芥探究其基因功能。主要獲得的實驗結(jié)果如下:1.以全綠稈為材料,通過RACE技術(shù)克隆了PvLhca1和PvLhca2的cDNA全長,PvLhca1和PvLhca2的cDNA全長分別為741bp和為789bp,分別編碼246和262個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。它們有三個典型的α跨膜螺旋。進化樹分析表明它們與毛竹(Phyllostachys edulis)中的相應(yīng)蛋白親緣關(guān)系最近。2.分別采集黃稈烏哺雞竹全綠與全黃竹筍的四個節(jié)間組織:白色、淺綠(淺黃)、淡綠(淡黃)和全綠節(jié)間(全黃節(jié)間),以及條紋竹筍的三個節(jié)間不同條紋區(qū)(淺綠、淺黃、淡綠、淡黃、深綠和深黃條紋)。分別刮取節(jié)間外表皮,提取RNA,通過實時定量RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),相比于綠稈竹筍,在全黃稈竹筍逐漸著色階段,PvLhca1和PvLhca2基因表達量相對較低,有可能影響葉綠素的積累,調(diào)控稈色變化。3.蛋白質(zhì)是基因功能的體現(xiàn)者,制備PvLhca1和PvLhca2抗體,利用WB(Western Blot)技術(shù)檢測PvLhca1和PvLhca2在黃色和綠色條紋中的蛋白表達量。結(jié)果表明,PvLhca1蛋白產(chǎn)物在淺綠條紋中的表達量明顯高于淺黃條紋,與定量RT-PCR結(jié)果一致。PvLhca2蛋白產(chǎn)物分子大小高于預測的分子量,推測PvLhca2蛋白產(chǎn)物易與PvLhca3蛋白產(chǎn)物形成二聚體。4.構(gòu)建植物過表達載體pC1301-PvLhca1和pC1301-PvLhca2,轉(zhuǎn)化擬南芥,PCR和RT-PCR檢測表明PvLhca1和PvLhca2整合入擬南芥基因組并轉(zhuǎn)錄,轉(zhuǎn)基因植株的葉片平均數(shù)分別為28和25片,明顯多于野生型擬南芥平均數(shù)15片;轉(zhuǎn)基因植株光系統(tǒng)Ⅰ電子傳遞效率(ETR,electron transport rate)比野生型擬南芥植株明顯降低。這些結(jié)果說明,過量表達的PvLhca1與PvLhca2降低了光系統(tǒng)I電子傳遞效率,可能引起植株的吸收光譜發(fā)生變化。5.分別克隆了全綠稈與全黃稈PvLhca1和PvLhca2基因的cDNA序列和DNA序列,序列比對表明來源于不同稈色的PvLhca1和PvLhca2基因的cDNA序列無差異。全黃稈中PvLhca1和PvLhca2基因DNA序列均與全綠稈內(nèi)的基因序列有差異。具體表現(xiàn)為全黃稈中PvLhca1為全綠稈中PvLhca1序列中第二內(nèi)含子一段序列移動至其第三內(nèi)含子。全黃稈中PvLhca2基因DNA序列相比于全綠稈中PvLhca2基因缺失了所有的內(nèi)含子。內(nèi)含子位置的改變與缺失可能影響了全黃稈中PvLhca1和PvLhca2的表達模式的變化。6.通過基因組步移法,分別克隆PvLhca1和PvLhca2上游調(diào)控序列,獲得全綠稈中PvLhca1上游調(diào)控序列139bp,全黃稈中PvLhca1上游調(diào)控序列1121bp;獲得全綠稈中PvLhca2基因上游調(diào)控序列286bp,全黃稈中PvLhca2基因上游調(diào)控序列372bp�，F(xiàn)有序列比對得出PvLhca1和PvLhca2基因上游的調(diào)控序列黃稈和綠稈中并無差異。通過PlantCARE檢測到PvLhca1和PvLhca2上游調(diào)控序列中均有溫度相關(guān)響應(yīng)元件與光響應(yīng)元件�？傊�,本課題克隆了PvLhca1和PvLhca2基因全長序列,轉(zhuǎn)基因結(jié)果表明PvLhca1和PvLhca2基因的過表達可能導致光合電子傳遞效率的降低。相比全綠稈,在全黃稈逐漸著色時期PvLhca1和PvLhca2基因相對表達量低于全綠稈,WB檢測同樣證明兩個基因蛋白產(chǎn)量相對較低,這些表達量的變化可能導致了LHCⅠ不能完美組裝,從而影響了全黃稈葉綠素的沉積和稈色的變化。比較了全綠稈和全黃稈間PvLhca1和PvLhca2 DNA序列的不同,發(fā)現(xiàn)基因內(nèi)含子位置的變化和缺失可能影響了PvLhca1和PvLhca2在全黃稈中的表達模式。
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【學位授予單位】：浙江農(nóng)林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S795

【參考文獻】

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本文編號：1720060