本文選題：馬爾堡病毒　切入點：糖蛋白受體結(jié)合域　出處：《中國獸醫(yī)學(xué)報》2017年07期

【摘要】：原核表達并純化馬爾堡病毒(Marburg virus,MARV)糖蛋白(glycoprotein,GP)受體結(jié)合域(receptor binding domain,RBD)蛋白,并以此為抗原免疫家兔制備抗MARV-GP-RBD多克隆抗體。參照GenBank提供的MARV GP全基因序列,找到主要抗原表位區(qū)域,設(shè)計特異性引物,采用PCR方法擴增RBD基因,擴增產(chǎn)物經(jīng)雙酶切(EcoRⅠ/XhoⅠ)后定向克隆至原核表達載體pET-30a(+),構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-30a(+)-GP-RBD,轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)表達宿主菌,在不同條件下(時間、IPTG濃度、溫度)誘導(dǎo)表達目的蛋白,并用His-Band N+柱進行親和層析純化;以純化的重組pET-30a(+)-GP-RBD蛋白免疫家兔,制備多克隆抗體。通過SDS-PAGE、Western blot和IFA鑒定重組蛋白的反應(yīng)原性及免疫原性。結(jié)果顯示:PCR擴增到長度為453bp的RBD基因片段;構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-30a(+)-GP-RBD經(jīng)雙酶切后得到與目的片段長度相同的特異性條帶,測序結(jié)果顯示沒有突變;轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在培養(yǎng)7h、終濃度為0.4mmol/L IPTG和37℃條件下能夠充分誘導(dǎo)目的蛋白表達,得到相對分子質(zhì)量為25 000的重組蛋白,主要以包涵體形式存在,BCA試劑盒產(chǎn)量測定,每升誘導(dǎo)的重組菌可純化約20mg純度較高的目的蛋白;Western blot檢測證實重組pET-30a(+)-GP-RBD蛋白能同時被抗His標簽的單抗和兔源多抗識別并發(fā)生特異性反應(yīng),證明重組蛋白有良好的反應(yīng)原性;IFA鑒定證實所制備的兔源多抗能夠特異性識別表達MARV GP蛋白的重組桿狀病毒rBacmid-GP-VP40,證明重組蛋白具有良好的免疫原性。結(jié)果表明:成功表達、純化了MARV GP RBD蛋白,并完成了兔源多抗的制備,為MARV亞單位疫苗的制備和抗原、抗體檢測方法的建立奠定基礎(chǔ)。
[Abstract]:The recombinant plasmid pET - 30a ( + ) - GP - RBD was cloned into the prokaryotic expression vector pET - 30a ( + ) . The recombinant plasmid pET - 30a ( + ) - GP - RBD was cloned into the prokaryotic expression vector pET - 30a ( + ) . The recombinant plasmid pET - 30a ( + ) - GP - RBD was cloned into the prokaryotic expression vector pET - 30a ( + ) . The preparation of rabbit polyclonal antibody is completed , which lays a foundation for the preparation of MARV subunit vaccine and the establishment of antigen and antibody detection method .

【作者單位】： 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院;軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所/吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點實驗室;吉林大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院;東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院;
【基金】：國家科技重大專項(重大新藥創(chuàng)制)資助項目(2015ZX09102025)
【分類號】：S852.65

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本文編號：1718028