發(fā)布時(shí)間：2018-04-06 06:31

  本文選題：必需基因　切入點(diǎn)：過(guò)表達(dá)省略抑制子　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2016年博士論文

【摘要】：在單細(xì)胞物種中,必需基因可被簡(jiǎn)單定義為在正常培養(yǎng)條件下對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的基因。因此必需基因�？刂萍�(xì)胞內(nèi)核心的生物學(xué)過(guò)程,也在不同物種間具有很高的保守性[1]。功能基因組學(xué)的研究表明,有些基因在不同的物種間顯示出不同的必需性[2],這表明基因的必需性受遺傳環(huán)境影響。遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)還曾發(fā)現(xiàn)某些必需基因缺失造成的致死表型可以被單個(gè)突變所挽救,這種突變被稱(chēng)為省略抑制子。為系統(tǒng)研究省略抑制現(xiàn)象,我們?cè)谒诰屏阎辰湍窼. pombe中對(duì)其TT號(hào)染色體左臂的165個(gè)必需基因開(kāi)展了省略抑制子篩選。在本課題中,我們通過(guò)覆蓋幾乎整個(gè)基因組的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒文庫(kù)觀(guān)察單個(gè)基因的過(guò)表達(dá)對(duì)必需基因缺失的彌補(bǔ)性影響。我們首先在S. pombe中建立了一套可靠的篩選過(guò)表達(dá)省略抑制子(overexpression-mediated bypass-of-essential-gene (0-BOE) suppressors)的方法,并成功對(duì)128個(gè)必需基因進(jìn)行了O-BOE的篩選以及鑒定。通過(guò)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)在S. pombe的基因組中,約12.5%的必需基因缺失的致死表型能被單個(gè)過(guò)表達(dá)質(zhì)粒所挽救(省略抑制)。而大部分必需基因都篩選不到過(guò)表達(dá)省略抑制子,這表明細(xì)胞內(nèi)的必需基因不是同等重要的。通過(guò)分析我們發(fā)現(xiàn)有0-BOE抑制子的必需基因與沒(méi)有O-BOE抑制子的必需基因相比,基因的進(jìn)化速率更快,在不同物種間的保守性更低。同時(shí),在蛋白質(zhì)相互作用的網(wǎng)絡(luò)中,這些基因也不傾向成為網(wǎng)絡(luò)中的中心,和形成聚集的模塊。這表明這些可被省略抑制的必需基因,在特征上更接近非必需基因。通過(guò)分析過(guò)表達(dá)省略抑制相互作用的模式,我們發(fā)現(xiàn)編碼同一個(gè)蛋白復(fù)合體中不同蛋白的必需基因,或者在相同生物學(xué)通路中起作用的必需基因的過(guò)表達(dá)省略抑制子之間會(huì)出現(xiàn)交集,這表明系統(tǒng)性的省略抑制子研究有可能幫助我們找到必需基因相互作用的模塊。而我們進(jìn)一步的分析表明,過(guò)表達(dá)省略抑制遺傳相互作用有助于揭示基因的必需生物學(xué)功能,如resl可被Cdc18過(guò)表達(dá)省略抑制,這表明resl的必需功能可能是在細(xì)胞周期的G1/S轉(zhuǎn)變過(guò)程中激活Cdc18的轉(zhuǎn)錄；同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)多個(gè)磷脂酶的過(guò)表達(dá)可以省略抑制ERMES (ER-mitochondria encounter site)復(fù)合體中的基因,這意味著ERMES復(fù)合體的必需功能與脂質(zhì)的調(diào)控有關(guān)；同時(shí)過(guò)表達(dá)省略抑制相互作用可將不同的生物學(xué)過(guò)程之間建立聯(lián)系,比如線(xiàn)粒體核糖體亞基mrp21與mrps28的缺失可被參與小分子RNA代謝過(guò)程的Dcr1省略抑制提示線(xiàn)粒體功能與小分子RNA之間可能存在聯(lián)系。這些例子表明過(guò)表達(dá)省略抑制相互作用不僅可以揭示細(xì)胞內(nèi)不同生物學(xué)過(guò)程之間的關(guān)系、發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的必需功能模塊,同時(shí)也為我們研究必需基因在細(xì)胞內(nèi)的功能提供有價(jià)值的線(xiàn)索。SUMO靶向泛素連接酶(STUbL)是一類(lèi)從單細(xì)胞酵母至人中結(jié)構(gòu)與功能都非常保守的蛋白。這類(lèi)酶的存在表明細(xì)胞內(nèi)被SUMO修飾的蛋白可能會(huì)被蛋白酶體降解。在酵母S. cerevisiae以及人細(xì)胞中,STUbL調(diào)節(jié)的一些底物已經(jīng)被發(fā)現(xiàn),但細(xì)胞內(nèi)SUMO與泛素(ubiquitin)之間的這種交互對(duì)話(huà)的生物學(xué)意義以及STUbL家族主要在細(xì)胞內(nèi)調(diào)控的生物學(xué)過(guò)程仍舊不清楚。在粟酒裂殖酵母S. pombe中,STUbL的功能由復(fù)合體Slx8-Rfp1/Rfp2實(shí)現(xiàn),且STUbL的功能對(duì)于S. pombe細(xì)胞的生長(zhǎng)是必需的。必需基因通常調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)非�；A(chǔ)核心的生物學(xué)過(guò)程,因此研究S1x8的必需功能不僅可幫助我們認(rèn)識(shí)STUbL在S. pombe中的作用機(jī)理,也可能幫助我們理解整個(gè)STUbL家族蛋白主要調(diào)控的生物學(xué)過(guò)程。我們通過(guò)piggyBac (PB)轉(zhuǎn)座子以及酵母的過(guò)表達(dá)文庫(kù)對(duì)必需基因的省略抑制子篩選發(fā)現(xiàn)S1x8的缺失造成的致死表型可被多個(gè)基因的功能缺失或過(guò)表達(dá)挽救。我們著重通過(guò)轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的省略抑制子(T-BOE)對(duì)Slx8的必需功能進(jìn)行了機(jī)理的研究。我們發(fā)現(xiàn)S1x8的必需功能與細(xì)胞內(nèi)被SUMO修飾的蛋白有關(guān),突變參與SUMO修飾過(guò)程的基因(pli1△、fub2_C_ins)可顯著降低細(xì)胞內(nèi)整體水平的SUMO修飾而省略抑制Slx8的必需功能。Slx8的必需功能與核孔復(fù)合體以及Ulpl之間也存在著密切相關(guān)性：核孔蛋白Nup132的缺失、Nup189 C端氨基酸的缺失,以及去SUMO修飾蛋白酶Ulp2的缺失均可省略抑制S1x8的必需功能,同時(shí)這些突變也影響去SUMO修飾蛋白酶Ulpl在核膜上的定位。我們的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明,這些突變可能通過(guò)影響Ulpl蛋白在核膜上的定位而省略抑制S1x8的必需功能。T-BOE實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)一個(gè)功能不明確的蛋白R(shí)rp2的缺失也可省略抑制S1x8的必需功能。我們通過(guò)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)該蛋白的SUMO結(jié)合序列SIM對(duì)于其在s1x8突變體中發(fā)揮生長(zhǎng)抑制作用(毒性)有非常重要的作用,這表明Rrp2蛋白可能與被SUMO修飾的底物直接結(jié)合而產(chǎn)生毒性。不僅如此,我們也發(fā)現(xiàn)Rrp2可能具有通過(guò)其N(xiāo)端區(qū)域自我相互作用形成多聚體的能力。通過(guò)ChIP-seq實(shí)驗(yàn)我們還發(fā)現(xiàn)Rrp2特異結(jié)合于基因組的非編碼區(qū)域,這一發(fā)現(xiàn)表明S1x8的必需功能可能與Rrp2對(duì)非編碼區(qū)域的DNA調(diào)節(jié)有關(guān)。因此我們對(duì)S1x8的研究提示,Slx8的必需功能可能是調(diào)節(jié)細(xì)胞核內(nèi)染色體上的Rrp2與核孔復(fù)合體定位的Ulpl之間的某種生物學(xué)聯(lián)系。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：Q78
，

本文編號(hào)：1718407