本文選題：必需基因　切入點：過表達省略抑制子　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學院》2016年博士論文

【摘要】：在單細胞物種中,必需基因可被簡單定義為在正常培養(yǎng)條件下對細胞生長所必需的基因。因此必需基因�？刂萍毎麅群诵牡纳飳W過程,也在不同物種間具有很高的保守性[1]。功能基因組學的研究表明,有些基因在不同的物種間顯示出不同的必需性[2],這表明基因的必需性受遺傳環(huán)境影響。遺傳學實驗還曾發(fā)現(xiàn)某些必需基因缺失造成的致死表型可以被單個突變所挽救,這種突變被稱為省略抑制子。為系統(tǒng)研究省略抑制現(xiàn)象,我們在粟酒裂殖酵母S. pombe中對其TT號染色體左臂的165個必需基因開展了省略抑制子篩選。在本課題中,我們通過覆蓋幾乎整個基因組的過表達質粒文庫觀察單個基因的過表達對必需基因缺失的彌補性影響。我們首先在S. pombe中建立了一套可靠的篩選過表達省略抑制子(overexpression-mediated bypass-of-essential-gene (0-BOE) suppressors)的方法,并成功對128個必需基因進行了O-BOE的篩選以及鑒定。通過我們的實驗結果,我們發(fā)現(xiàn)在S. pombe的基因組中,約12.5%的必需基因缺失的致死表型能被單個過表達質粒所挽救(省略抑制)。而大部分必需基因都篩選不到過表達省略抑制子,這表明細胞內的必需基因不是同等重要的。通過分析我們發(fā)現(xiàn)有0-BOE抑制子的必需基因與沒有O-BOE抑制子的必需基因相比,基因的進化速率更快,在不同物種間的保守性更低。同時,在蛋白質相互作用的網(wǎng)絡中,這些基因也不傾向成為網(wǎng)絡中的中心,和形成聚集的模塊。這表明這些可被省略抑制的必需基因,在特征上更接近非必需基因。通過分析過表達省略抑制相互作用的模式,我們發(fā)現(xiàn)編碼同一個蛋白復合體中不同蛋白的必需基因,或者在相同生物學通路中起作用的必需基因的過表達省略抑制子之間會出現(xiàn)交集,這表明系統(tǒng)性的省略抑制子研究有可能幫助我們找到必需基因相互作用的模塊。而我們進一步的分析表明,過表達省略抑制遺傳相互作用有助于揭示基因的必需生物學功能,如resl可被Cdc18過表達省略抑制,這表明resl的必需功能可能是在細胞周期的G1/S轉變過程中激活Cdc18的轉錄；同時我們發(fā)現(xiàn)多個磷脂酶的過表達可以省略抑制ERMES (ER-mitochondria encounter site)復合體中的基因,這意味著ERMES復合體的必需功能與脂質的調控有關；同時過表達省略抑制相互作用可將不同的生物學過程之間建立聯(lián)系,比如線粒體核糖體亞基mrp21與mrps28的缺失可被參與小分子RNA代謝過程的Dcr1省略抑制提示線粒體功能與小分子RNA之間可能存在聯(lián)系。這些例子表明過表達省略抑制相互作用不僅可以揭示細胞內不同生物學過程之間的關系、發(fā)現(xiàn)細胞內的必需功能模塊,同時也為我們研究必需基因在細胞內的功能提供有價值的線索。SUMO靶向泛素連接酶(STUbL)是一類從單細胞酵母至人中結構與功能都非常保守的蛋白。這類酶的存在表明細胞內被SUMO修飾的蛋白可能會被蛋白酶體降解。在酵母S. cerevisiae以及人細胞中,STUbL調節(jié)的一些底物已經被發(fā)現(xiàn),但細胞內SUMO與泛素(ubiquitin)之間的這種交互對話的生物學意義以及STUbL家族主要在細胞內調控的生物學過程仍舊不清楚。在粟酒裂殖酵母S. pombe中,STUbL的功能由復合體Slx8-Rfp1/Rfp2實現(xiàn),且STUbL的功能對于S. pombe細胞的生長是必需的。必需基因通常調節(jié)細胞內非�；A核心的生物學過程,因此研究S1x8的必需功能不僅可幫助我們認識STUbL在S. pombe中的作用機理,也可能幫助我們理解整個STUbL家族蛋白主要調控的生物學過程。我們通過piggyBac (PB)轉座子以及酵母的過表達文庫對必需基因的省略抑制子篩選發(fā)現(xiàn)S1x8的缺失造成的致死表型可被多個基因的功能缺失或過表達挽救。我們著重通過轉座子介導的省略抑制子(T-BOE)對Slx8的必需功能進行了機理的研究。我們發(fā)現(xiàn)S1x8的必需功能與細胞內被SUMO修飾的蛋白有關,突變參與SUMO修飾過程的基因(pli1△、fub2_C_ins)可顯著降低細胞內整體水平的SUMO修飾而省略抑制Slx8的必需功能。Slx8的必需功能與核孔復合體以及Ulpl之間也存在著密切相關性：核孔蛋白Nup132的缺失、Nup189 C端氨基酸的缺失,以及去SUMO修飾蛋白酶Ulp2的缺失均可省略抑制S1x8的必需功能,同時這些突變也影響去SUMO修飾蛋白酶Ulpl在核膜上的定位。我們的實驗進一步表明,這些突變可能通過影響Ulpl蛋白在核膜上的定位而省略抑制S1x8的必需功能。T-BOE實驗還發(fā)現(xiàn)一個功能不明確的蛋白Rrp2的缺失也可省略抑制S1x8的必需功能。我們通過進一步分析發(fā)現(xiàn)該蛋白的SUMO結合序列SIM對于其在s1x8突變體中發(fā)揮生長抑制作用(毒性)有非常重要的作用,這表明Rrp2蛋白可能與被SUMO修飾的底物直接結合而產生毒性。不僅如此,我們也發(fā)現(xiàn)Rrp2可能具有通過其N端區(qū)域自我相互作用形成多聚體的能力。通過ChIP-seq實驗我們還發(fā)現(xiàn)Rrp2特異結合于基因組的非編碼區(qū)域,這一發(fā)現(xiàn)表明S1x8的必需功能可能與Rrp2對非編碼區(qū)域的DNA調節(jié)有關。因此我們對S1x8的研究提示,Slx8的必需功能可能是調節(jié)細胞核內染色體上的Rrp2與核孔復合體定位的Ulpl之間的某種生物學聯(lián)系。
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【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q78
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本文編號：1718407