發(fā)布時(shí)間：2018-04-06 00:39

  本文選題：大黃魚　切入點(diǎn)：免疫刺激　出處：《集美大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：小G蛋白是重要的分子開關(guān),可以調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂、細(xì)胞骨架形成、囊泡運(yùn)輸、核質(zhì)運(yùn)輸?shù)榷喾N細(xì)胞功能,在免疫中發(fā)揮重要作用。本研究克隆得到大黃魚Rac1、Rac2、Rac3、Rab7和Rab5A(分別稱為lycRac1、lycRac2、lycRac3、lycRab7和lycRab5A)的cDNA序列,通過與基因組序列圖比對獲得完整的基因序列,分析了這些基因的分子特征、組織表達(dá)特性,以及LPS、PolyI:C、副溶血弧菌等刺激后大黃魚肝臟、脾臟和腎臟中的表達(dá)變化并對利用免疫膠體金技術(shù)對肝臟中表達(dá)的lycRAC2進(jìn)行亞細(xì)胞定位,利用GSTPulldown和質(zhì)譜鑒定研究了與lyc RAB5A互作的蛋白質(zhì)。主要結(jié)果如下:1、RAC蛋白包括3個(gè)類型,分別為Rac1、Rac2和Rac3。lycRac1的cDNA全長2329 bp,ORF為579 bp,編碼192個(gè)氨基酸;lycRac2的cDNA全長1221 bp,ORF為579 bp,編碼192個(gè)氨基酸;lycRac3的cDNA全長2182 bp,ORF為579 bp,編碼192個(gè)氨基酸。氨基酸多重比對顯示,lycRac1與海龜(Chelonia mydas)、斑馬魚(Maylandia zebra)和紅鰭東方渶(Takifugu rubripes)的Rac1基因有高相似性;lycRac2與尖吻鱸(Lates calcarifer)、亞馬遜花溕(Poecilia formosa)和劍魚(Xiphophorus maculatus)同源性高;lycRac3與牛(Bos taurus)、熱帶爪蟾(Xenopus tropicalis)和藍(lán)鯰魚(Ictalurus furcatus)有較高同源性。通過基因組分析發(fā)現(xiàn)lycRac1有6個(gè)外顯子,5個(gè)內(nèi)含子;lycRac2有7個(gè)外顯子,6個(gè)內(nèi)含子;lycRac3有7個(gè)外顯子,6個(gè)內(nèi)含子。進(jìn)化樹分析表明,lycRac1、lycRac2和lycRac3均與魚類Rac1、Rac2和Rac3聚成一支。利用熒光定量PCR技術(shù)檢測三個(gè)基因在組織中的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)它們在所有檢測的組織中均可以表達(dá),其中,lycRac1在心臟中的表達(dá)量最高,血液和腦中也有較高的表達(dá),頭腎中的表達(dá)量最低;lycRac2在頭腎中的表達(dá)量最高,腎臟和脾臟中也有較高的表達(dá),肌肉中的表達(dá)量最低;lycRac3在血液中的表達(dá)量最高,脾臟和腦中也有較高的表達(dá),腸中的表達(dá)量最低。大黃魚受到Lpopolysaccharide,Polyinosinic Polycytidylic acid和Vibrio Parahemolyticus刺激后lycRac1、lycRac2和lycRac3在肝臟、脾臟、頭腎中的表達(dá)量有不同程度的升高,純化的lycRAC2蛋白制得多抗,Western-blot結(jié)果顯示多抗特異性較高。免疫電鏡結(jié)果表明,lycRAC2亞細(xì)胞定位于細(xì)胞間質(zhì)。以上結(jié)果表明,lycRac1、lycRac2和lycRac3可能是與免疫相關(guān)的基因,它們在應(yīng)對細(xì)菌感染中發(fā)揮不可或缺的作用,lycRAC2的亞細(xì)胞定位進(jìn)一步說明lycRac2與信號傳遞有關(guān)。2、Rab7是屬于Ras家族的小G蛋白,lycRab7的cDNA全長2218bp,開放閱讀框(ORF)624 bp,編碼207個(gè)氨基酸。氨基酸多重比對結(jié)果顯示,lycRab7與斑馬魚(Danio rerio)、人(Homo sapiens)、家兔(Oryctolagus cuniculus)的Rab7基因同源性較高。通過基因組分析發(fā)現(xiàn),lycRab7有5個(gè)外顯子,4個(gè)內(nèi)含子。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明,lycRab7與其它魚類可以聚成一支。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,lycRab7在12個(gè)組織中均有表達(dá),其中腦中的表達(dá)量最高,血液和心臟中也有較高的表達(dá),胃中的表達(dá)量最低。大黃魚受到LPS、polyI:C、副溶血弧菌刺激后,肝臟、脾臟和頭腎中l(wèi)ycRab7的表達(dá)量均明顯上調(diào)。純化的lycRAB7蛋白制得多抗,Western-blot結(jié)果顯示多抗特異性較高。以上結(jié)果表明,lycRab7在抵御細(xì)菌入侵中發(fā)揮重要作用。3、Rab5A是Ras家族的一員,已得到純化的lyc RAB5A蛋白,根據(jù)GST pull down結(jié)果可知,lycRAB5A蛋白與腺苷三磷酸酶(Calcium-transporting ATPase)、肌酸激酶(Creatine kinase M-type)、肌動(dòng)蛋白(Actin,alpha skeletal muscle)等蛋白互作。結(jié)果表明lycRAB5A與其他蛋白協(xié)同在機(jī)體免疫中發(fā)揮作用。
[Abstract]:The cDNA sequences of lycRac1 , Rac2 , Rac3 , Rab7 and Rab5A ( lycRac1 , lycRac2 , lycRac3 , lycRab7 and lycRab5A ) were sequenced . The results showed that lycRac1 , lycRac2 and lycRac3 were highly expressed in the liver , spleen and head kidney . The results showed that lycRac1 , lycRac2 and lycRac3 were highly expressed in liver , spleen and head kidney . The results showed that lycRab7 plays an important role in resisting bacterial invasion . The results show that lycRab7 plays an important role in resisting bacterial invasion . The results show that lycRab7 plays an important role in resisting bacterial invasion .

【學(xué)位授予單位】：集美大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1717222