本文選題：重編程　切入點(diǎn)：多能干細(xì)胞　出處：《江蘇大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：2006年,Yamanaka等首次實(shí)現(xiàn)了由轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的體細(xì)胞重編程,命名為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs),自此,細(xì)胞重編程技術(shù)成為生命科學(xué)與再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。通過病毒等載體介導(dǎo),在體細(xì)胞內(nèi)異位表達(dá)與細(xì)胞多能性相關(guān)的關(guān)鍵因子(如Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4等),可以實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞向多能狀態(tài)的逆轉(zhuǎn),最終生成表型和分化潛能均類似于胚胎干細(xì)胞的iPSCs。由于iPSCs來源于患者自身的體細(xì)胞,且具有與胚胎干細(xì)胞相當(dāng)?shù)淖晕腋履芰拖蛉邔臃只臐撃?將iPSCs作為一種替代胚胎干細(xì)胞的種子細(xì)胞應(yīng)用于臨床,可避免胚胎干細(xì)胞涉及的倫理和法律問題,且iPSCs源于患者自身體細(xì)胞,可實(shí)現(xiàn)病人的個性化治療。目前,iPSCs的臨床應(yīng)用還面臨許多困難,諸如,傳統(tǒng)的病毒轉(zhuǎn)染方法和癌癥相關(guān)因子(如c-Myc)的應(yīng)用存在安全隱患,而非病毒方法的重編程效率低下,難以滿足臨床對于iPSCs安全性和數(shù)量的需求等等,因此,研究探索安全、高效的重編程策略具有重要的價值和意義。本文從基于天然多糖的重編程轉(zhuǎn)錄因子OCT4納米傳遞、重編程因子組合的篩選、基于組織工程三維體系的細(xì)胞重編程三個方面,研究探索安全、高效的體細(xì)胞重編程新策略。第一章細(xì)胞重編程的研究進(jìn)展對細(xì)胞重編程的概念及研究進(jìn)展進(jìn)行了闡述；對細(xì)胞重編程技術(shù)在人類疾病治療、藥物開發(fā)以及生物發(fā)育等領(lǐng)域的應(yīng)用和意義進(jìn)行了探討；通過大量資料查閱,對細(xì)胞重編程的方法進(jìn)行了綜述；闡述了細(xì)胞重編程技術(shù)的研究現(xiàn)狀及其應(yīng)用于臨床實(shí)踐所面臨的問題,提出了本論文的立題依據(jù)、設(shè)計(jì)思路與構(gòu)想,為本論文實(shí)驗(yàn)工作的順利進(jìn)行提供了理論依據(jù)。第二章基于天然多糖的重編程轉(zhuǎn)錄因子OCT4納米傳遞研究采用水提醇沉、樹脂純化的工藝提取分離了4種高純度、分子量分布集中的天然多糖(文中分別以字母A、B、C、D表示)；采用三種陽離子化方法,即精胺(Sp)、乙二胺(Ed)和聚乙烯亞胺(PEI)修飾的方法,分別對所得的每種多糖進(jìn)行陽離子化修飾；選擇與體細(xì)胞重編程密切相關(guān)的胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子OCT4作為模型基因,通過瓊脂糖凝膠電泳篩選出了與質(zhì)粒OCT4的結(jié)合效果最佳的4種陽離子多糖(A-Ed、B-PEI、C-Ed和D-Sp)進(jìn)行后續(xù)基因轉(zhuǎn)染效率評價；透射電鏡觀察、粒徑分析以及Zeta電位測定結(jié)果表明：陽離子多糖能有效壓縮、包裹大分子質(zhì)粒OCT4,得到形態(tài)規(guī)則、表面帶正電荷的球形或橢球形的納米粒；MTT比色法證明了陽離子多糖/OCT4納米粒具有良好的生物安全性；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、RT-PCR以及活細(xì)胞工作站等技術(shù)分別從目的蛋白表達(dá)水平、RNA轉(zhuǎn)錄水平以及納米粒入胞過程等方面對陽離子多糖/OCT4納米粒的基因轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行綜合評價,從多方面證明了陽離子多糖是一種理想的細(xì)胞重編程載體材料。第三章重編程因子組合的篩選與細(xì)胞重編程研究通過對OCT4、SOX2和miR302-367這3個因子進(jìn)行隨機(jī)組合,采用陽離子多糖D-Sp作為基因載體,制備了一系列多糖-基因納米粒；以qRT-PCR考察了細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率,并通過堿性磷酸酶染色,統(tǒng)計(jì)陽性克隆數(shù),篩選出了最佳的因子組合：OCT4、SOX2和miR302-367；選用該組合與陽離子多糖D-Sp制備得到D-Sp/OS-miR納米粒,對人源體細(xì)胞進(jìn)行重編程研究；經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、透射電鏡觀察、粒徑測定以及電位測量等一系列檢測,結(jié)果顯示：D-Sp/OS-miR納米粒在質(zhì)量比為10：1時,粒徑最小,且集中分布在70～150 nm的區(qū)間內(nèi),納米粒呈形態(tài)規(guī)整、分散均勻、表面帶正電荷的球形或橢球形；qRT-PCR、免疫熒光、Western blot以及HE組織染色等方法證明了D-Sp/OS-miR納米粒誘導(dǎo)生成的iPSCs能夠表達(dá)胚胎干細(xì)胞多能性標(biāo)記,并且在體、內(nèi)外均能夠向內(nèi)、中、外三個胚層進(jìn)行分化。第四章基于組織工程三維體系的細(xì)胞重編程研究首次嘗試在三維體系中細(xì)胞重編程的可能性。采用直接凍干、不添加任何交聯(lián)劑的方法制備了膠原支架,并對支架進(jìn)行了形態(tài)、孔隙率和吸水率等表征；以陽離子多糖D-Sp、磷酸鈣以及編碼Yamanaka因子的4種質(zhì)粒為原料,采用反相微乳法制備了多糖-磷酸鈣混雜納米粒,通過形態(tài)觀察、粒徑測定、Zeta電位測量以及瓊脂糖凝膠電泳等實(shí)驗(yàn)對納米粒的性質(zhì)進(jìn)行了表征；將多糖-磷酸鈣混雜納米粒吸附到空白膠原支架內(nèi)表面,得到三維載基因納米粒-膠原支架；掃描電鏡下觀察到三維載基因納米粒-膠原支架內(nèi)部疏松多孔的微觀結(jié)構(gòu),孔徑適宜、相互連通的支架孔道有效模擬了細(xì)胞在體內(nèi)生長的三維微環(huán)境；將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞接種于三維載基因納米粒-膠原支架進(jìn)行重編程,隨著培養(yǎng)時間的延長,細(xì)胞在支架中形成了邊界清晰、形態(tài)規(guī)整的球形或橢球形的iPSC細(xì)胞球；RT-PCR檢測結(jié)果顯示：在三維載基因納米粒-膠原支架中,每一個重編程轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量都顯著高于二維體系(*,P0.05),且持續(xù)時間延長；HE染色、免疫組化、免疫熒光、染色體核型分析以及啟動子甲基化測定等實(shí)驗(yàn)從形態(tài)、蛋白水平以及基因水平等多方面證明了iPSCs細(xì)胞球的多能性；在三維支架中誘導(dǎo)生成的細(xì)胞球能夠在二維滋養(yǎng)層細(xì)胞上持續(xù)、穩(wěn)定地傳代至20代以上,并建立穩(wěn)定的細(xì)胞系；體內(nèi)畸胎瘤實(shí)驗(yàn)最終證明：三維載基因納米粒-膠原支架能夠成功誘導(dǎo)iPSCs的生成。結(jié)論本論文成功篩選出基于天然多糖的非病毒納米基因載體,并應(yīng)用于重編程轉(zhuǎn)錄因子OCT4納米傳遞,通過對納米粒的表征和基因轉(zhuǎn)染效率的考察,證明了陽離子多糖作為重編程基因載體的巨大潛能；以安全性良好的microRNA替代癌癥相關(guān)基因C-MYC和KLF4,形成一個全新的非致癌三因子組合,OCT4+SOX2+miR302-367,然后以篩選出的陽離子多糖為基因載體,成功誘導(dǎo)人iPSCs生成；首次構(gòu)建了基于組織工程三維支架的體細(xì)胞重編程體系,實(shí)驗(yàn)證明：與二維環(huán)境相比,三維體系中的細(xì)胞重編程轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平高且持續(xù)時間長,重編程速度快、效率高,而且只需一步轉(zhuǎn)染,誘導(dǎo)生成的iPSCs夠在二維滋養(yǎng)層細(xì)胞上持續(xù)、穩(wěn)定地?cái)U(kuò)增,為后續(xù)iPSCs的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R329.2
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本文編號：1716851