本文選題：結(jié)直腸癌　切入點(diǎn)：外泌體　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2017年碩士論文

【摘要】：結(jié)直腸癌(colorectal cancer;CRC)是全球發(fā)病率第三位,致死率第四位的惡性腫瘤。它的發(fā)生、發(fā)展與環(huán)境、遺傳等多種因素密切相關(guān),是多基因、多步驟的累積過程。近年來,我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率與死亡率也逐年上升,且發(fā)病年齡呈年輕化趨勢。由于早期無明顯的病理癥狀,大部分結(jié)直腸癌患者初診時即為轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌(metastatic colorectal cancer;mCRC),即使部分患者接受了手術(shù)治療,仍會出現(xiàn)術(shù)后的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移,因此,化療在結(jié)直腸癌,尤其是轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的治療中至關(guān)重要。FOLFOX和FOLFIRI作為目前化療的一線治療方案,能夠有效緩解患者病情,但患者的中位生存期仍不到2年。靶向EGFR單克隆抗體-西妥昔單抗(Cetumimab)和帕尼單抗(Panitumumab)的出現(xiàn),成為治療結(jié)直腸癌的重大突破。靶向EGFR單克隆抗體,通過與EGFR配體表皮生長因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子α(TGF-α)等競爭性的結(jié)合EGFR的胞外區(qū),阻止EGFR的激活,阻斷EGFR下游信號通路,從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移。然而,并非所有患者都能從EGFR單抗靶向治療中受益,目前研究認(rèn)為,靶向EGFR單克隆抗體療效受到EGFR信號通路基因突變的影響,通過對KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA等基因的突變檢查,可以篩查耐藥的患者。因此,靶向治療前與治療中的基因突變檢測十分重要�；蛲蛔儥z測,目前主要依賴組織學(xué)檢查,標(biāo)本來源于手術(shù)、結(jié)腸鏡或穿刺活檢,然而這些侵入性的檢查,并不是所有患者都可以接受。并且,對已經(jīng)進(jìn)行了原發(fā)腫瘤根治性切除的結(jié)直腸癌患者而言,受轉(zhuǎn)移灶的大小和位置等原因限制,獲取轉(zhuǎn)移灶的腫瘤組織在臨床常常是較為困難的,會對患者造成一定的傷害,存在著較大的風(fēng)險(xiǎn)。此外,腫瘤異質(zhì)性的存在,易造成檢測結(jié)果的假陰性。因此,基于血液的非侵入性檢查代替組織學(xué)檢查將會是檢測腫瘤基因突變的理想選擇。外泌體是一種30~150nm的雙層膜囊泡,廣泛分布存在于各種體液。作為一類重要的細(xì)胞間通訊分子,外泌體含有豐富的蛋白質(zhì)、脂類以及多種核酸,且內(nèi)含物與來源細(xì)胞具有一致性。在腫瘤中,由于腫瘤細(xì)胞與周圍支持細(xì)胞間信號交流的需求量增加,外泌體的分泌量明顯增加。因此,對腫瘤患者的血清外泌體內(nèi)含物進(jìn)行分析和檢測,可輔助腫瘤的早期診斷、療效評價(jià)和預(yù)后分析。本研究希望通過對結(jié)直腸癌患者血清外泌體中DNA、mRNA的檢測與腫瘤組織檢測結(jié)果對比,達(dá)到用外泌體DNA、mRNA檢測替代腫瘤組織基因突變檢測,以輔助早診、臨床用藥指導(dǎo)以及評估。本研究中,我們收集了90例臨床確診結(jié)直腸癌患者的全血標(biāo)本,分別提取血細(xì)胞DNA、外泌體DNA以及外泌體mRNA。將3種核酸標(biāo)本分別進(jìn)行KRAS G12/G13、KRAS Q61,BRAF V600,NRAS Q61以及PIK3CA E542/E545、H1047相應(yīng)片段的PCR擴(kuò)增。通過對PCR產(chǎn)物進(jìn)行高通量測序,檢測90例結(jié)直腸癌患者血細(xì)胞DNA、血清外泌體DNA與mRNA中的突變情況,并與臨床組織學(xué)檢查結(jié)果相比較。本研究結(jié)果顯示,通過高通量測序,90例結(jié)直腸癌患者外泌體DNA和m RNA中均檢出不同頻率的8種類型的基因突變,分別為:KRAS基因中G12D、G12V、G12A、G12S和G13D,PIK3CA基因中E542K、E545K、H1047R。外泌體DNA中共檢出54例突變患者(突變率60.00%),其中KRAS基因突變51例(突變率為56.67%),PIK3CA基因突變42例(突變率為46.67%),KRAS基因合并PIK3CA基因突變的患者39例(突變率為43.33%)。KRAS基因中,檢出G12D突變42例(突變率為46.67%),G12V突變1例(突變率為1.11%),G12A突變1例(突變率為1.11%),G12S突變1例(突變率為1.11%),G13D突變25例(突變率為27.78%);PIK3CA基因中,檢出E542K突變20例(突變率為22.22%),E545K患者10例(突變率為11.11%),H1047R突變27例(突變率為30%)。外泌體mRNA中共檢出49例突變患者(突變率為54.44%),其中KRAS基因突變40例(突變率為44.44%),PIK3CA基因突變39例(突變率為43.33%),KRAS基因合并PIK3CA基因突變的患者30例(突變率為33.33%)。KRAS基因中,檢出G12D突變32例(突變率為35.56%),G12V突變1例(突變率為1.11%),G12A突變1例(突變率為1.11%),G12S突變1例(突變率為1.11%),G13D突變17例(突變率為18.89%)。PIK3CA基因中,檢出E542K突變16例(突變率為17.78%),E545K突變檢出9例(突變率為10%),H1047R突變檢出24例(突變率為26.67%)。本研究進(jìn)一步對90例結(jié)直腸癌患者外泌體DNA與血細(xì)胞DNA進(jìn)行相應(yīng)基因突變頻率的比較,結(jié)果顯示血細(xì)胞DNA突變頻率均小于1%,提示外泌體DNA中的突變來自于腫瘤細(xì)胞,可以反映腫瘤組織的突變。為了進(jìn)一步探討外泌體中DNA與mRNA的突變是否與組織相關(guān),本研究將外泌體DNA與mRNA的KRAS基因突變檢測結(jié)果分別與組織DNA檢測結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果顯示,外泌體DNA中,KRAS G12突變檢測靈敏度為90.63%,特異度為75.86%,與組織學(xué)檢測一致性為81.11%;KRAS G13突變檢測靈敏度為100%,特異度為82.28%,與組織學(xué)檢測一致性為84.44%。外泌體mRNA中,KRAS G12突變檢測靈敏度為68.75%,特異度為81.03%,與組織學(xué)檢測一致性為76.67%;KRAS G13突變檢測靈敏度為63.63%,特異度為87.34%,與組織學(xué)檢測一致性為84.44%。提示外泌體DNA與mRNA的突變檢測能夠反應(yīng)腫瘤組織DNA的突變情況,兩種檢測方法均顯示出了較好的臨床應(yīng)用的潛在價(jià)值,尤其是外泌體DNA的突變檢測,顯示出了更好的敏感性與一致性。在外泌體DNA與mRNA的比較研究中,mRNA中突變的患者均存在DNA突變,且二者突變類型一致,但mRNA中突變檢出率為DNA的70.00%~85.00%。此外,各基因中DNA突變頻率高于mRNA患者的數(shù)量均超過85.00%。以上兩方面均說明外泌體mRNA中存在突變基因的低表達(dá)或不表達(dá),通過對外泌體mRNA的突變檢測可以了解突變基因在轉(zhuǎn)錄組中的影響。本研究進(jìn)一步對KRAS G12、KRAS G13、PIK3CA E542、PIK3CA E545和PIK3CA H1047在外泌體DNA與mRNA的檢測突變率進(jìn)行比較,結(jié)果顯示,各基因突變檢測在外泌體mRNA與DNA比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究還收集了20例使用西妥昔單抗治療的結(jié)直腸癌患者的血清標(biāo)本,對西妥昔治療過程中外泌體DNA突變進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測研究。結(jié)果顯示,外泌體DNA的突變水平與西妥昔的療效具有密切相關(guān)性,突變頻率的增高能夠早期預(yù)示西妥昔耐藥,且預(yù)測能力優(yōu)于目前臨床腫瘤標(biāo)志物。外泌體DNA突變水平的檢測可以實(shí)現(xiàn)臨床腫瘤實(shí)時微創(chuàng)監(jiān)測,可能成為指導(dǎo)臨床靶向EGFR單抗治療的新方法。綜上所述,外泌體中DNA與RNA的突變檢測可以反映腫瘤組織的突變狀態(tài),并且外泌體含量豐富、取材簡便,可實(shí)現(xiàn)腫瘤突變的檢測、監(jiān)測,在臨床應(yīng)用中,具有巨大的潛在價(jià)值。
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【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.34

【參考文獻(xiàn)】

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1 Margot Zller;;Pancreatic cancer diagnosis by free and exosomal miRNA[J];World Journal of Gastrointestinal Pathophysiology;2013年04期

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本文編號：1710387