本文選題：柑桔全爪螨　切入點(diǎn)：超氧化物歧化酶　出處：《西南大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：當(dāng)生物體遭受環(huán)境脅迫時(shí),體內(nèi)會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的活性氧(ROS),ROS的累積會(huì)破壞蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)膜等大分子結(jié)構(gòu)。超氧化物歧化酶是生物體內(nèi)最重要的抗氧化酶之一,對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)的ROS平衡起著至關(guān)重要的作用。柑桔全爪螨是一種寄主范圍廣,發(fā)生持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)的世界性害螨,目前對(duì)該螨的防治手段主要以化學(xué)防治為主,殺螨劑長(zhǎng)期不科學(xué)的使用使柑桔全爪螨產(chǎn)生了較為嚴(yán)重的抗藥性,因此亟需從可持續(xù)及綠色的角度重新思考對(duì)該螨的防控策略。據(jù)此,為深入了解柑桔全爪螨對(duì)環(huán)境脅迫的適應(yīng)機(jī)制,本學(xué)位論文對(duì)柑桔全爪螨的超氧化物歧化酶基因進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究,主要結(jié)果如下:1.柑桔全爪螨3個(gè)SOD基因的序列及系統(tǒng)發(fā)育分析根據(jù)本課題組測(cè)序獲得的柑桔全爪螨轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),篩選目標(biāo)序列及設(shè)計(jì)引物,克隆獲得了3個(gè)SOD基因的開放閱讀框,分別命名為PcSOD1(KJ522695)、PcSOD2(KJ700412)和PcSOD3(KJ700411)。通過編碼蛋白質(zhì)的分子量、特征序列和信號(hào)肽結(jié)構(gòu)分析,結(jié)果表明柑桔全爪螨PcSOD1、PcSOD2和PcSOD3基因分屬于細(xì)胞質(zhì)CuZnSOD、細(xì)胞外CuZnSOD和線粒體MnSOD。氨基酸多重序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn),SOD1和SOD3在不同物種間的相似性高達(dá)70%,而SOD2的相似度僅為35%左右。系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析結(jié)果表明所有的SOD蛋白被劃分為3個(gè)大的分支,說明柑桔全爪螨3個(gè)SOD基因在金屬結(jié)合位點(diǎn)、特征基序和相對(duì)分子量等方面存在差異,可能導(dǎo)致其抗氧化功能亦存在差異。2.柑桔全爪螨SOD基因在環(huán)境脅迫條件下的表達(dá)模式解析環(huán)境脅迫能夠?qū)е律矬w內(nèi)ROS的累積,從而誘導(dǎo)SOD基因的表達(dá)上調(diào)。研究選取了重金屬、殺螨劑、紫外線(UV-B)和極端溫度4種類型的環(huán)境脅迫條件,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)柑桔全爪螨PcSOD1、PcSOD2和PcSOD3在氧化脅迫條件下的表達(dá)特性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,在UV-B和極端溫度(0°C和41°C)脅迫下,PcSOD1、PcSOD2和PcSOD3的表達(dá)水平均顯著性上調(diào),且上調(diào)倍數(shù)較高,說明UV-B和極端溫度是導(dǎo)致柑桔全爪螨體內(nèi)產(chǎn)生氧化損傷的重要環(huán)境因子。在重金屬離子(Mn2+、Cu2+和Cd2+)、0°C和UV-B處理后,PcSOD3的表達(dá)水平均顯著高于另外2個(gè)CuZnSOD基因,說明MnSOD基因是典型的誘導(dǎo)性基因,同時(shí)暗示PcSOD3可能比PcSOD1和PcSOD2具有更為重要的抗氧化功能。3.柑桔全爪螨PcSOD3的原核表達(dá)以大腸桿菌BL21(DE3)作為原核表達(dá)菌株,成功實(shí)現(xiàn)了pET28α-PcSOD3重組蛋白的異源表達(dá),利用重組蛋白所含有的His標(biāo)簽與Ni柱結(jié)合,獲得純化的重組蛋白。通過Western Blot驗(yàn)證,表明所獲得的重組蛋白為PcSOD3重組蛋白,該重組蛋白酶活力為276.61 U/mg,說明該重組蛋白具有抗氧化功能。酶學(xué)性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)該重組蛋白酶促反應(yīng)的最適溫度為35℃,最適pH為7.0。4.柑桔全爪螨MnSOD和CuZnSOD抗氧化功能差異分析在大腸桿菌中過量表達(dá)PcSOD1、PcSOD2和PcSOD3的基礎(chǔ)上,以pET28α空載體為對(duì)照,基于濾紙片藥敏法測(cè)量三種氧化脅迫條件下的抑菌圈直徑,分析3個(gè)SOD重組蛋白的抗氧化功能差異。結(jié)果顯示,在三種氧化脅迫條件下,大腸桿菌中過量表達(dá)PcSOD3后抑菌圈的縮小程度均高于過量表達(dá)PcSOD1和PcSOD2后的抑菌圈直徑,說明柑桔全爪螨MnSOD(PcSOD3)比CuZnSOD(PcSOD1和PcSOD2)具有更強(qiáng)的抗氧化能力。綜上所述,本學(xué)位論文為探究超氧化物歧化酶基因參與柑桔全爪螨對(duì)環(huán)境脅迫的適應(yīng)機(jī)制,從轉(zhuǎn)錄組篩選獲得了3種不同亞型的超氧化物歧化酶基因序列,驗(yàn)證后命名為PcSOD1、PcSOD2和PcSOD3,分析了3個(gè)基因的序列特征和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系以及在環(huán)境脅迫下的表達(dá)模式;通過對(duì)上述基因進(jìn)行原核表達(dá)和藥敏試驗(yàn),對(duì)3個(gè)基因的抗氧化功能進(jìn)行了初步分析。研究結(jié)果為深入探究超氧化物歧化酶在柑桔全爪螨抗氧化脅迫中的生理功能和制訂害螨新的防控策略提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S436.661.23

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