本文選題：甜瓜　切入點(diǎn)：伐昔洛韋水解酶　出處：《內(nèi)蒙古大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：甜瓜(Cucumis melo L.)是世界十大水果之一,具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,也是研究葫蘆科植物果實(shí)發(fā)育成熟的模式植物。2012年6月甜瓜全基因組測(cè)序已完成并公布,為利用生物信息學(xué)方法研究新基因及其功能奠定了基礎(chǔ)。本研究利用生物信息學(xué)方法從甜瓜基因組中鑒定了伐昔洛韋水解酶(valacyclovir hydrolase,VACVase)、持綠蛋白(staygreen protein,SGR)和非黃化蛋白(non-yellow coloring,NYC)基因家族,并進(jìn)行了生物信息學(xué)、表達(dá)特性、亞細(xì)胞定位和功能分析。主要結(jié)果如下：1)本文從甜瓜基因組中鑒定得到兩個(gè)VACVase,命名為CmVACVase1和CmVACVase2,通過生物信息學(xué)分析表明,該蛋白家族高度保守,兩個(gè)蛋白均無信號(hào)肽結(jié)構(gòu),屬于非分泌性蛋白,CmVACVase1和CmVACVase2分別含有4個(gè)和3個(gè)跨膜結(jié)構(gòu),屬于跨膜蛋白,且分別含有24和15個(gè)磷酸化位點(diǎn)。通過啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn),除了核心元件(CAAT-box、TATA-box、5'UTR Py-rich等)外,含有多種激素應(yīng)答元件、組織特異表達(dá)以及時(shí)空特異表達(dá)的調(diào)控元件。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析中分別獲得了一個(gè)高度同源的映射蛋白,且分別與10個(gè)和8個(gè)蛋白進(jìn)行互作。每個(gè)基因均搜索得到了2個(gè)miRNA,一個(gè)是通過互補(bǔ)形式降解靶mRNA,另一個(gè)是通過阻遏靶mRNA的翻譯來抑制目的基因的表達(dá)。從甜瓜基因組中鑒定得到一個(gè)NYC蛋白和4個(gè)與NYC同源的SGR蛋白,分別命名為CmNYC、CmSGR1～CmSGR4。生物信息學(xué)分析顯示,CmNYC蛋白含有酯酶/脂肪酶亞家族保守基序(G-X-S-X-G/A),是一個(gè)偏弱酸性的不穩(wěn)定蛋白,其N末端無葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽結(jié)構(gòu),含有兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu),屬于跨膜蛋白,且含有27個(gè)磷酸化位點(diǎn)。SGR基因家族是NYC蛋白的同源基因,具有相似的功能,該家族蛋白C末端含有一個(gè)高度保守的基序(C-X3-C-X-C2-F-P-X5-P),但是在進(jìn)化過程中,CmSGR3、CmSGR4則缺失了該基序,其家族蛋白的N末端均無葉綠體定位信號(hào)肽結(jié)構(gòu),也沒有跨膜結(jié)構(gòu),不屬于跨膜蛋白。2)從甜瓜中分別克隆得到了CmVACVase1、CmVACVase2、CmNYC、CmSGR1、 CmSGR2五個(gè)基因的cDNA,分別編碼458、398、499、216和257個(gè)氨基酸,分子量在24.8-55.4 kDa之間。3)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR, qPCR)結(jié)果顯示,CmVACVase1、CmVACVase2在45 DAP的果實(shí)中表達(dá)量最高,分別是葉片中表達(dá)量的355倍和2.6倍,果實(shí)發(fā)育初期表達(dá)量最低,屬于果實(shí)成熟過程中高表達(dá)基因。CmNYC在葉片和子葉中的表達(dá)量較高,而果實(shí)中表達(dá)量較低,但隨著果實(shí)發(fā)育其表達(dá)量開始緩慢上升。CmSGR1、CmSGR2的表達(dá)量在45 DAP的果實(shí)中最高,并且隨著果實(shí)發(fā)育成熟其表達(dá)量緩慢上升。而CmSGR3、CmSGR4在葉片、莖和子葉中表達(dá)較高,在果實(shí)授粉后其表達(dá)量開始緩慢降低,到30DAP后表達(dá)量有所增加,但幅度不大。4)構(gòu)建CmVACVase1和CmVACVase2的亞細(xì)胞定位載體pUC18-CmVACVase1-GFP和pUC18-CmVACVase2-GFP,轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞,CmVACVase1和CmVACVase2均定位于細(xì)胞膜上,屬于一類膜蛋白,與預(yù)測(cè)結(jié)果一致。5)瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果顯示,CmVACVase1和CmVACVase2基因的過表達(dá)和RNAi果實(shí)注射部位均呈現(xiàn)綠色表型。注射p35S-VACVase1和p35S-VACVase2的果實(shí)中表達(dá)量分別為對(duì)照組的2.21和2.25倍,在CmVACVase1過表達(dá)果實(shí)中,木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶/水解酶(Xyloglucan Endotransglucosylase/hydrolase, XTH)基因表達(dá)量是對(duì)照組的8.1倍,在CmVACVase2過表達(dá)果實(shí)中,擴(kuò)張蛋白(expansion protein, EXP)和八氫番茄紅素合成酶(1phytoene synthase, PSY)基因表達(dá)量分別為對(duì)照組的1.7倍和1.5倍。在CmVACVasel的RNAi果實(shí)中,ACC氧化酶(ACC oxidase, ACO)和ACC合成酶(ACC synthetase, ACS)基因表達(dá)量分別為對(duì)照組的3.2倍和2.2倍,其它果實(shí)發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)量受到明顯的抑制。在CmVACVase2的RNAi果實(shí)中,p-半乳糖苷酶(β-galactosidase,β-gal)和EXP基因表達(dá)量分別為對(duì)照組的51倍和23倍。注射p35S-NYC、p35S-SGR1、 p35S-SGR2果實(shí)部位均呈現(xiàn)黃色表型,葉綠素降解明顯,而注射ART27-NYC、 pART27-SGR1、pART27-SGR2部位呈現(xiàn)出持綠特征。應(yīng)用生物信息學(xué)方法首次從甜瓜全基因中鑒定得到CmVACVase1、 CmVACVase2、 CmNYC、 CmSGRl、CmSGR2基因并克隆了其cDNA,明確其家族基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、編碼蛋白質(zhì)的基序特點(diǎn)和分布,通過瞬時(shí)表達(dá)的方法來研究該基因家族的功能,為深入研究其作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。對(duì)CmVACVasel、CmVACVase2在植物體內(nèi)的催化功能提供新的認(rèn)識(shí),為進(jìn)一步探究CmVACVase家族基因在植物體內(nèi)的功能提供基礎(chǔ)研究資料。為進(jìn)一步明確CmNYC/CmSGR對(duì)甜瓜葉綠素降解、衰老、果實(shí)成熟的調(diào)控分子機(jī)理打下了良好的基礎(chǔ)。
[Abstract]:In this paper , we identified two kinds of genes , such as valeroxide , VACVase , staygreen protein , SGR and non - yellow protein . The expression of CmSGR3 and CmSGR 2 , CmSGR1 , CmSGR2 , CmSGR1 , CmSGR2 , CmSGR1 , CmSGR2 , CmSGR1 , CmSGR2 , CmSGR1 , CmSGR2 , CmSGR1 , CmSGR2 , CmSGR1 , CmSGR2 and CmVase2 were the highest in 45 DAP . In the fruit of CmVACVase2 , the expression of ACC oxidase ( ACC oxidase , ACO ) and ACC synthetase ( ACC oxidase , ACS ) was significantly inhibited .

【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S652

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1696887