本文選題：萊茵衣藻　切入點：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)　出處：《上海海洋大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC)在高等植物中可以固定CO2,但是對真核藻PEPC的功能研究較少,尤其是“細菌型”磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC2)。為了探究PEPC2功能,并構(gòu)建高產(chǎn)油工程藻,本文嘗試用抑制萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)PEPC表達的方法來提高萊茵衣藻的脂質(zhì)含量。萊茵衣藻PEPC有五段保守序列(CS),兩個活性位點(H和K),本文克隆了萊茵衣藻“細菌型”PEPC的CSⅠ序列起始的639bp,該片段還包含了一個活性位點(H),構(gòu)建了p SP124s-HRreve-Crpepc2和pSP124s-HR-forw-Crpepc2兩種萊茵衣藻細胞核表達載體和pASapl-forw-Crpepc2和pASapI-reve-Crpepc2兩種萊茵衣藻葉綠體表達載體,通過萊茵衣藻細胞核轉(zhuǎn)化和葉綠體轉(zhuǎn)化來探究萊茵衣藻“細菌型”PEPC對其代謝產(chǎn)物的影響。第一章探究了用細胞核轉(zhuǎn)化調(diào)控萊茵衣藻“細菌型”PEPC表達后,對萊茵衣藻及其突變株的各項生理生化指標的影響。結(jié)果表明,反向突變株的Crpepc2基因被下調(diào),有高光合效率和較低的暗呼吸,這可能與降低的光飽和點和提高的光補償點有關(guān)。相反,正向型突變株的Crpepc2基因被上調(diào),具有較高的暗呼吸效率和較低的光合效率,這可能是因為光補償點降低,光飽和點提高了。在這項研究中我們發(fā)現(xiàn)PEPC的活性與蛋白質(zhì)和油脂的積累也有關(guān)系,正向突變株有較高的PEPCase活性,促進了蛋白質(zhì)的積累;反向突變株P(guān)EPCase活性被抑制促進了油脂的生物合成。對Crpepc2基因的抑制還增強了反向型突變株對低溫和pH的耐受性。不僅如此,反向型突變株的不飽和脂肪酸含量增加,這可能與其抗性增強有關(guān)根據(jù)以上數(shù)據(jù),我們提出下述假設(shè):萊茵衣藻的PEPC可能是一種平衡C和N代謝的連接酶。PEPCase活性的下調(diào)提高了光合作用,并促進PEP流向脂質(zhì)合成。此外,PEPCase的上調(diào)提高了呼吸作用,并促進蛋白質(zhì)的合成。因此PEPC不僅能影響萊茵衣藻的光合作用和碳代謝,還能影響N化合物和能量的代謝。第2章和第3章將克隆的639bp片段通過葉綠體轉(zhuǎn)化的方法克隆進入萊茵衣藻cc-400品系中,并檢測了cc-400野生型及其突變株的生理生化指標的變化情況。葉綠體轉(zhuǎn)化我們做得比細胞核晚,但其具有高轉(zhuǎn)化與表達效率,且在定向轉(zhuǎn)化葉綠體的問題已經(jīng)解決,所以用萊茵衣藻的葉綠體轉(zhuǎn)化方法將更有助于提高其代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。首先本實驗通過熒光定量PCR方法檢測了Crpepc2的相對表達量,至今還未見到有關(guān)Crpepc2基因葉綠體表達的報道。其次,觀察到PEPC可以調(diào)控光合產(chǎn)物的分配,所以過表達的PEPC促進蛋白質(zhì)的合成,并抑制PEPC的表達促進脂質(zhì)的積累。有意思的是調(diào)控PEPC表達,對突變株的生長影響不大。綜上所述,萊茵衣藻葉綠體轉(zhuǎn)化方法產(chǎn)生的突變株其各項生理生化指標跟細胞核轉(zhuǎn)化方法產(chǎn)生的突變株表現(xiàn)出相似的現(xiàn)象,萊茵衣藻“細菌型”PEPC可以調(diào)控蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的積累,且不影響藻的生長,蛋白質(zhì)含量的提高有助于今后外源性蛋白的表達,脂質(zhì)含量的提高有助于構(gòu)建高產(chǎn)油工程藻。與細胞核轉(zhuǎn)化可發(fā)現(xiàn)葉綠體轉(zhuǎn)化有以下特點:反向葉綠體轉(zhuǎn)化株的油脂含量增加了70.32%,反向細胞核轉(zhuǎn)化株的油脂含量增加了39.24%,是核轉(zhuǎn)化的數(shù)據(jù)的1.79倍;同時脂肪酸含量也較高,尤其是不飽和脂肪酸含量。在光合參數(shù)方面:反向細胞核突變株的光飽和點增加了19.06%,反向葉綠體突變株增加了29.49%;反向細胞核突變株的光補償點下降了26.09%,反向葉綠體突變株降低了51.31%。呼吸作用方面:正向細胞核突變株增加了19.77%,正向葉綠體突變株提高了32.44%;反向細胞核突變株下降了21.22%,反向葉綠體突變株降低了28.21%。蛋白質(zhì)含量的變化:正向細胞核突變株蛋白質(zhì)含量增加了26.99%,正向葉綠體突變株增加了37.03%。通過上述分析發(fā)現(xiàn),不管是細胞核突變株還是葉綠體突變株生理生化指標均表現(xiàn)出相似的趨勢,但是葉綠體轉(zhuǎn)化方法表現(xiàn)出的趨勢更加明顯,油脂和蛋白質(zhì)含量均提高較多,兩種轉(zhuǎn)化均說明PEPC2會影響萊茵衣藻的光合作用,葉綠體轉(zhuǎn)化的數(shù)據(jù)也支持我們的假設(shè)�；剂献鳛椴豢稍偕茉�,將在數(shù)十年內(nèi)耗盡,生物能源尤其是微藻生物柴油具有清潔、來源廣泛及用途廣等優(yōu)點,成為最有希望的石油替代能源之一。通過篩選含油量高的藻株或從生理生化水平提高細胞含油量,難以在生長和含油率中找到平衡點,難以在生產(chǎn)中應(yīng)用,且難以真正降低生產(chǎn)成本,近40年來已做了許多努力,但難以產(chǎn)業(yè)化。因此,大家越來越寄希望于用基因工程手段提高產(chǎn)油率。本文構(gòu)建的反向突變株有可能為產(chǎn)油工程藻做貢獻。
[Abstract]:In order to explore the function of PEPC and to construct high yield oil engineering algae , it is suggested that the activity of the reverse mutant strain is regulated and the light saturation point is improved . In the first chapter , we find that the activity of the reverse mutant strain is reduced and the light saturation point is improved . In this study , we suggest that the PEPC has higher photosynthetic efficiency and lower photosynthetic efficiency . In this study , we suggest that the PEPC has high photosynthetic efficiency and low photosynthetic efficiency . In the light of photosynthetic parameters : the light saturation point of reverse chloroplast transformed plant increased by 19.77 % , the reverse chloroplast mutant increased by 29.49 % , and the reverse chloroplast mutant increased by 29.49 % .

【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q943.2

【參考文獻】

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1 Xiao-Hui Jia;Peng-Peng Zhang;Ding-Ji Shi;Hua-Ling Mi;Jia-Cheng Zhu;Xi-Wen Huang;Pei-Min He;;Regulation of pepc gene expression in Anabaena sp. PCC 7120 and its effects on cyclic electron flow around photosystem I and tolerances to environmental stresses[J];Journal of Integrative Plant Biology;2015年05期

2 田琪琳;施定基;賈曉會;米華玲;黃希文;何培民;;“細菌型”pepc2基因反向表達載體構(gòu)建及在萊茵衣藻中的表達[J];上海海洋大學(xué)學(xué)報;2013年05期

3 韓建剛;荊玉靜;李萍萍;;乙醇提取浮游藻類葉綠素a的方法優(yōu)化研究[J];江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué);2013年01期

4 任聰;王丹;楊琳;朱曄榮;白艷玲;王勇;;葉綠體中表達外源蛋白的研究進展[J];科技通報;2012年03期

5 王金輝;李軼女;倪丕沖;王國增;張志芳;沈桂芳;;葉綠體轉(zhuǎn)化體系研究進展[J];生物技術(shù)通報;2012年01期

6 彭良才;;論中國生物能源發(fā)展的根本出路[J];華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(社會科學(xué)版);2011年02期

7 魯厚芳;史國強;劉穎穎;梁斌;;生物柴油生產(chǎn)及性質(zhì)研究進展[J];化工進展;2011年01期

8 侯李君;王學(xué)魁;施定基;;藍藻磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的生物信息學(xué)分析[J];生物技術(shù)通報;2008年04期

9 韓四海;胡章立;王潮崗;;外源基因在萊茵衣藻葉綠體中的表達[J];生物技術(shù)通報;2007年01期

10 劉建忠;敖敬;田為宇;馬季驊;;基因敲除技術(shù)研究進展[J];化學(xué)與生物工程;2006年02期

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本文編號：1696775