本文選題：胰腺癌　切入點(diǎn)：轉(zhuǎn)移　出處：《南京醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：目的胰腺癌是一種惡性程度高、易早期轉(zhuǎn)移、預(yù)后極差的消化系統(tǒng)腫瘤。深入研究胰腺癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移機(jī)制,對(duì)于控制其進(jìn)展,改善預(yù)后具有重要意義。慢性胰腺炎是胰腺癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素,有研究表明上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)與慢性炎癥疾病及腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),配對(duì)相關(guān)源框1(paired related homeobox 1, Prrx1)基因在肺癌、結(jié)腸癌和甲狀腺癌中多種實(shí)體瘤中高表達(dá),且其高表達(dá)與癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移正相關(guān)。但該基因在胰腺癌中研究甚少,分子機(jī)制尚不清楚。本研究旨在通過臨床組織水平和離體細(xì)胞水平的研究,闡明Prrx1基因在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及分子機(jī)制,為臨床探索胰腺癌基因治療的分子靶點(diǎn)提供新的思路。方法(一)臨床研究：收集胰腺癌、慢性胰腺炎以及正常胰腺組織標(biāo)本,應(yīng)用免疫組織化學(xué)法分別檢Prrx1和EMT相關(guān)分子E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)情況,分析不同組織中Prrx1、E-cadherin、Vimentin陽性表達(dá)率的差異,并分別分析Prrx1陽性表達(dá)率及E-cadherin、Vimentin陽性表達(dá)率與胰腺癌病理學(xué)特征之間的關(guān)系,進(jìn)一步探討Prrx1陽性表達(dá)率與E-cadherin、Vimentin陽性表達(dá)率之間是否具有相關(guān)性；(二)細(xì)胞學(xué)研究(1)培養(yǎng)人正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞HPDE6-C7和3株胰腺癌細(xì)胞(AsPC-1、BxPC-3和CFPAC-1),采用Western Blot方法檢測(cè)Prrx1蛋白在細(xì)胞株中表達(dá)情況；(2)根據(jù)Prrx1基因mRNA特點(diǎn),設(shè)計(jì)并合成3個(gè)小干擾RNA(siRNA),轉(zhuǎn)染胰腺癌BxPC-3細(xì)胞,采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR方法篩選下調(diào)效果最好的siRNA。(3)采用Prrx1基因過表達(dá)慢病毒載體轉(zhuǎn)染胰腺癌BxPC-3細(xì)胞,構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)Prrx1基因過表達(dá)細(xì)胞(簡(jiǎn)稱為Prrx1過表達(dá)細(xì)胞),分別采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR和Western Blot方法檢測(cè)癌細(xì)胞Prrx1基因(?)RNA和蛋白水平；采用顯微鏡觀察癌細(xì)胞形態(tài)；分別采用Western Blot和免疫熒光方法檢測(cè)各組癌細(xì)胞中E-cadherin和Vimentin蛋白情況；采用平板克隆方法觀察癌細(xì)胞增殖情況,采用劃痕修復(fù)試驗(yàn)觀察癌細(xì)胞遷移情況,采用Transwell方法觀察癌細(xì)胞侵襲能力；(4)采用Prrxl基因siRNA轉(zhuǎn)染Prrx1過表達(dá)細(xì)胞后,分別采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR和Western Blot方法檢測(cè)癌細(xì)胞Prrx1基因nRNA和蛋白水平；采用顯微鏡觀察癌細(xì)胞形態(tài)；分別采用Western Blot方法和免疫熒光方法檢測(cè)各組癌細(xì)胞中E-cadherin和Vimentin蛋白情況；采用平板克隆方法觀察癌細(xì)胞增殖情況,采用劃痕修復(fù)試驗(yàn)觀察癌細(xì)胞遷移情況,采用Transwell方法觀察癌細(xì)胞侵襲能力。(5)癌細(xì)胞發(fā)生EMT涉及許多信號(hào)途徑,為了進(jìn)一步了解Prrx1基因調(diào)控癌細(xì)胞中生物學(xué)行為的分子機(jī)制,本研究進(jìn)一步以BxPC-3過表達(dá)細(xì)胞為對(duì)照組,試驗(yàn)組分別采用]PI3K-Akt通路抑制齊JLY294002、NF-κB通路抑制劑PDTC以及Wnt通路抑制劑XAV939處理Prrx1 BxPC-3過表達(dá)細(xì)胞后,采用Western Blot方法檢鋇Prrx1和EMT相關(guān)分子的蛋白表達(dá)情況,從而初步探討Prrx1通過哪些通路誘導(dǎo)EMT發(fā)生。結(jié)果(一)臨床組織學(xué)研究結(jié)果 研究發(fā)現(xiàn),胰腺癌組織中Prrx1蛋白陽性表達(dá)率較慢性胰腺炎和正常胰腺組織顯著升高(尸值均0.05),并與患者年齡、腫瘤脈管淋巴管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及5年生存率相關(guān)(P值均0.05),而與患者性別、腫瘤位置、分化程度及腫瘤的浸潤(rùn)深度無關(guān)(P值均0.05)；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),Prrx1陽性表達(dá)與E-cadherin高表達(dá)之間呈負(fù)相關(guān)(P0.01,R-0.401)。 Prrx1陽性表達(dá)與Vimentin高表達(dá)之間呈正相關(guān)(P0.01,R0.361)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果提示,Prrx1基因過表達(dá)與EMT有關(guān)。(二)細(xì)胞學(xué)研究結(jié)果(1)培養(yǎng)人正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞和3株胰腺癌細(xì)胞,采用Western Blot方法檢測(cè)Prrx1蛋白在細(xì)胞株中表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Prrx1蛋白在HPDE-C7細(xì)胞表達(dá)極低,而在AsPC-1、BxPC-3和CFPAC-1均高表達(dá)。我們選取BxPC-1做進(jìn)一步研究。(2)采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR和Western Blot方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),篩選下調(diào)效果最好的siRNA。結(jié)果發(fā)現(xiàn),以siRNA-b下調(diào)Prrx1基因效果最好。本研究將采用siRNA-b為工具,觀察siRNA-b轉(zhuǎn)染對(duì)Prrx1過表達(dá)細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響及分子機(jī)制。(3)成功構(gòu)建了穩(wěn)定過表達(dá)Prrx1胰腺癌BxPC-3細(xì)胞(簡(jiǎn)稱Prrxl過表達(dá)細(xì)胞)。采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR和Western Blot方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與空白對(duì)照組比較,Prrx1過表達(dá)組細(xì)胞Prrx1基因nRNA和蛋白水平明顯升高；形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),Prrx1基因過表達(dá)組細(xì)胞由鵝卵石形變?yōu)榧忓N形,即出現(xiàn)EMT改變；Western blot結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組比較,Prrx1過表達(dá)組細(xì)胞上皮標(biāo)志物E-Cadherin表達(dá)下調(diào),間葉標(biāo)記物Vimentin表達(dá)上調(diào)；免疫熒光結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了過表達(dá)Prrx1:造成E-cadherin下調(diào)及Vimentin上調(diào)。以上結(jié)果表明Prrx1過表達(dá)能促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞EMT的發(fā)生,提示Prrx1基因過表達(dá)組細(xì)胞發(fā)生了EMT。(4)平板克隆試驗(yàn)、劃痕修復(fù)試驗(yàn)和Transwell方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與空白對(duì)照組比較,Prrx1基因過表達(dá)組細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力明顯升高。(5)采用siRNA-b轉(zhuǎn)染Prrx1過表達(dá)細(xì)胞后,分別采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR和Western Blot方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與Prrx1過表達(dá)組比較,siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞Prrx1基因]mRNA和蛋白水平明顯下調(diào),說明轉(zhuǎn)染成功；形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),Prrx1基因過表達(dá)組細(xì)胞紡錘形變?yōu)轾Z卵石形,即EMT現(xiàn)象出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)；Western blot結(jié)果顯示,與Prrx1過表達(dá)組比較,siRNA組細(xì)胞上皮標(biāo)志物E-Cadherin表達(dá)升高,間葉標(biāo)記物Vimentin表達(dá)降低；免疫熒光結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了siRNA轉(zhuǎn)染造成E-cadherin升高及Vimentin降低。以上結(jié)果表明,采用siRNA下調(diào)Prrx1基因表達(dá)后,Prrx1過表達(dá)細(xì)胞EMT出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)。(6)平板克隆試驗(yàn)、劃痕修復(fù)試驗(yàn)和Transwell方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與]Prrx1過表達(dá)組比較,siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力明顯降低。(7)信號(hào)通路抑制試驗(yàn)證實(shí),Prrx1至少可通過NF-κB和Wnt兩條信號(hào)通路介導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT。結(jié)論(1) Prrx1基因與胰腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān),可能是一種新的胰腺癌轉(zhuǎn)移促進(jìn)因子。(2) Prrx1通過誘導(dǎo)EMT發(fā)生,增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力。(3) NF-κB和Wnt信號(hào)途徑的激活,參與了Prrx1調(diào)控胰腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT。
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【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.9

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1 鄒晨;Prrx1基因在胰腺癌EMT中的作用及機(jī)制研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2016年

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本文編號(hào)：1657042