本文選題：金錢魚　切入點(diǎn)：下丘腦-垂體-性腺軸　出處：《上海海洋大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：在脊椎動物中,性腺的發(fā)育和配子的形成及成熟主要受腦或下丘腦-垂體-性腺軸(BPGHPG)的調(diào)節(jié)。脊椎動物下丘腦分泌的促性腺激素釋放激素,使垂體分泌促性腺激素(gonadotropin hormones,GtH),即促卵泡激素(follicle-stimulating hormone,FSH)和促黃體生成素(luteinizing hormone,LH)作用于性腺,誘導(dǎo)并調(diào)控配子的形成。硬骨魚類中,FSH和LH對生殖調(diào)控功能的實(shí)現(xiàn)依賴于跟它們的受體相結(jié)合,啟動下游信號傳導(dǎo)通路以及激活相關(guān)蛋白并誘導(dǎo)性激素的合成并且作用于配子的成熟及排放。本文以實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)的金錢魚(Scatophagus argus)為研究對象,運(yùn)用基因克隆技術(shù)、原核表達(dá)系統(tǒng)、組織學(xué)方法、實(shí)時(shí)定量熒光PCR、酶聯(lián)免疫測定(ELISA),對金錢魚的促性腺激素基因進(jìn)行克隆與序列分析、原核表達(dá)重組載體的構(gòu)建、重組蛋白的獲得及利用、注射和投喂處理后相關(guān)基因的表達(dá)、以及血清中性類固醇類激素含量的變化進(jìn)行了研究及分析。本研究相關(guān)結(jié)果如下:(1)目的基因的克隆:設(shè)計(jì)引物并利用基因克隆技術(shù)克隆金錢魚LH和FSH的cDNA全長序列的克隆。金錢魚FSH基因全長542bp,ORF為363bp,其編碼120個(gè)氨基酸。金錢魚LH的基因全長608bp,ORF框?yàn)?38bp,其編碼145個(gè)氨基酸。將金錢魚FSH和LH氨基酸序列與其它魚類進(jìn)行同源性比較,系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明,金錢魚FSH和LH的進(jìn)化地位與物種分類的地位是一致的,在進(jìn)化過程中比較保守。(2)重組蛋白的構(gòu)建:構(gòu)建GtH與載體pET-28a的重組質(zhì)粒,在經(jīng)優(yōu)化后的原核表達(dá)條件下,誘導(dǎo)表達(dá)獲得可溶的重組FSH和LH融合蛋白。經(jīng)過Ni2+-NTA親和層析柱純化,Western Blot檢測得到純化的FSH和LH重組蛋白,隨后進(jìn)行金錢魚注射及青淏(Oryzias latipe)投喂實(shí)驗(yàn)。(3)性腺組織學(xué)的觀察:對實(shí)驗(yàn)對象金錢魚和青淏分別進(jìn)行注射和投喂試實(shí)驗(yàn),然后依照組織學(xué)觀察方法分別進(jìn)行了掃描式電子顯微鏡(scanning Electron Microscope,SEM)和蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining,HE)觀察。經(jīng)注射處理后,掃描隧道電鏡觀察發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組金錢魚較對照組與空白組而言,卵巢中卵母細(xì)胞分化及成熟度較對照組更高。精巢中大部分精母細(xì)胞分化為支持細(xì)胞和精子,且精子成熟度較高。經(jīng)投喂處理后,組織學(xué)切片觀察發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)組青淏較對照組與空白組而言,卵巢中卵子成熟度較高,卵黃顆粒發(fā)育成熟。精巢中,精子細(xì)胞基本完全成熟,且部分已經(jīng)排出。(4)相關(guān)基因的表達(dá)分析:利用相對實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對金錢魚生殖軸相關(guān)基因,促性腺激素受體(gonadotropin hormone receptor,GtHR),抗繆勒氏管激素(anti-Mullerian hormone,Amh),類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白(steroidogenic acute regulatory protein,Star),17β-羥基類固醇脫氫酶(17β-hydroxysteroid dehydrogenase,17β-hsd)等在金錢魚性腺組織中不同表達(dá)情況進(jìn)行研究。經(jīng)重組GtH注射后,SaFSHR和SaLHR表達(dá)量顯著升高(p0.05,p0.01),Amh表達(dá)水平顯著下降(p0.05),Star和17β-hsd表達(dá)升高(p0.05,p0.05)。(5)類固醇類激素的測定:采用酶聯(lián)免疫測定法對金錢魚血清中性類固醇類激素,即雌二醇(Estradiol-17β,E2)和11-酮基睪酮(11-keto Testosterone,11-kT)分別進(jìn)行濃度測定,分別如下:雌性中,E2濃度分別約為312.77 pg/ml(0 dpt),337.90 pg/ml(7 dpt))和474.57 pg/ml(14 dpt),呈現(xiàn)上升趨勢(p0.05)。雄性中,11-kT濃度分別約為70.88 pg/ml(0 dpt),65.67 pg/ml(7 dpt)和135.65 pg/ml(14 dpt),濃度變化明顯升高(p0.01)。本研究初步闡述了金錢魚GtH對其HPG生殖軸的調(diào)控機(jī)制,結(jié)果表明FSH和LH激活類固醇合成過程,促進(jìn)的相關(guān)基因GtHR,Star,17β-hsd的表達(dá),進(jìn)而調(diào)控性類固醇激素E2和11-kT的生物合成,并作用于性腺發(fā)育和配子發(fā)生。另外,抑制Amh的表達(dá)以促進(jìn)雌二醇(estradiol,E2)和11-酮基睪酮(11-keto Testerone,11-kT)的生物合成使得卵黃發(fā)生和配子形成。研究結(jié)果為揭示金錢魚繁殖調(diào)控的內(nèi)分泌機(jī)制提供了初步的基礎(chǔ)資料,并且獲得一種可能促進(jìn)魚類性腺發(fā)育的蛋白飼料添加劑,旨在將來為水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)做出貢獻(xiàn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：上海海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S917.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1656466