本文選題：銅綠假單胞菌　切入點：鼠李糖脂　出處：《西北大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：鼠李糖脂是近年來受到廣泛關(guān)注的生物表面活性劑之一,因應(yīng)用范圍廣以及環(huán)境友好等特點,使其成為潛在的合成表面活性劑的替代品。然而,鼠李糖脂的生產(chǎn)存在產(chǎn)量低、規(guī)模小以及成本高等問題,大大限制了其在工業(yè)規(guī)模上的使用。銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂最理想的菌株之一,但其鼠李糖脂的生物合成受到環(huán)境因子、營養(yǎng)因素以及復(fù)雜基因調(diào)控的影響,其中基因表達(dá)調(diào)控QS系統(tǒng)(rhl系統(tǒng)、las系統(tǒng)和pqs系統(tǒng))的作用又與環(huán)境因子以及營養(yǎng)因素密切相關(guān)。本研究以銅綠假單胞菌(Paerwginosa)PAO1為對象,采用Plackett-Burman(PB)設(shè)計和響應(yīng)曲面方法(RSM)對其產(chǎn)鼠李糖脂的發(fā)酵條件進行多因素優(yōu)化。PB試驗設(shè)計顯示磷酸鹽濃度、pH值和C/N比3個因素對鼠李糖脂的產(chǎn)量具有顯著影響,其中最顯著的影響因素是磷酸鹽濃度;通過RSM對3個顯著因素的最佳水平范圍進行分析,結(jié)果表明當(dāng)磷酸鹽濃度為1.71 g/L、pH值為6.0、C/NL比為15.5時,菌株P(guān)AO1合成鼠李糖脂的產(chǎn)量可高達(dá)20.72 g/L,比優(yōu)化前鼠李糖脂產(chǎn)量12.63 g/L提高了64.05%,很接近理論預(yù)測值21.35 g/L。在此基礎(chǔ)上,選取最顯著影響因素磷酸鹽濃度,研究不同磷酸鹽濃度對菌株P(guān)AO1合成鼠李糖脂的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)磷酸鹽濃度為0.01-0.5 g/L(即低磷濃度)時,其鼠李糖脂的產(chǎn)量比最佳水平磷酸鹽濃度時的產(chǎn)量高;尤其當(dāng)磷酸鹽濃度為0.5 g/L時,鼠李糖脂產(chǎn)量最高達(dá)到24.93 g/L。但是,當(dāng)培養(yǎng)基中不含磷酸鹽時,鼠李糖脂的產(chǎn)量僅有16.86 g/L。血平板實驗顯示在磷酸鹽濃度為0.5 g/L時溶血圈最大,與鼠李糖脂的產(chǎn)量結(jié)果一致;SDS-PAGE凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)菌株P(guān)A01在不同磷酸鹽濃度下有相應(yīng)的差異蛋白表達(dá)。采用qPCR的方法,對不同磷酸鹽濃度下rhl系統(tǒng)、las系統(tǒng)以及雙組份調(diào)控系統(tǒng)相關(guān)基因的相對表達(dá)量進行測定。結(jié)果顯示:rhlI、rhlR、lasI、lasR、rsaL、phoB、phoR基因的相對表達(dá)量均發(fā)生明顯的變化。由此可見,不同磷酸鹽濃度對銅綠假單胞菌合成鼠李糖脂及其基因表達(dá)調(diào)控有影響。為了進一步探究銅綠假單胞菌在不同磷酸鹽濃度下對鼠李糖脂合成的影響,構(gòu)建了 rhl系統(tǒng)突變菌(△rlI、△rhlR)和las系統(tǒng)突變菌(△lasI、△lasR、△rsaL),分別對其在不同磷酸鹽濃度下鼠李糖脂的產(chǎn)量及其相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控進行研究。結(jié)果表明:在低磷條件下,△rhlI和△rhlR的鼠李糖脂產(chǎn)量(18.35 g/L和16.04 g/L)相比PA01的產(chǎn)量(24.93g/L)分別下降了 26.39%和35.66%,△lasI和△lassR的鼠李糖脂產(chǎn)量變化不明顯,尤其是AlasI在此條件下的合成量(23.3 g/L)與PA01的產(chǎn)量幾乎一致,而△rsaL的鼠李糖脂產(chǎn)量(28.36g/L)比PA01的產(chǎn)量提高了 13.88%。qPCR結(jié)果顯示:rhl系統(tǒng)突變菌中rhlA、rhlB基因的相對表達(dá)量較低,但△lasI和△lasR中rhlA、rhlB基因的相對表達(dá)并未受到太大影響,而ArsaL中rhlA、rhlB基因的相對表達(dá)升高;rhl系統(tǒng)突變菌和△rsaL中phoB、phoR基因的相對表達(dá)量下降,AlasI和△lasR中相對表達(dá)量無明顯變化。在無磷條件下,△rhlR和△lasR的鼠李糖脂產(chǎn)量(12.86g/L和13.02 g/L)相比野生菌 PAO1 的產(chǎn)量(16.86 g/L)分別下降了 15.79%和 22.78%,ArhlI和△lasI在此條件下的鼠李糖脂合成量與野生菌的產(chǎn)量一致,而△rsaL的產(chǎn)量(20.12 g/L)比PAO1的產(chǎn)量提高了 19.34%。qPCR結(jié)果顯示,△tasR和△rhlR中基因rhlA、rhlB的相對表達(dá)量有明顯的下調(diào),而△rsaL中表達(dá)量明顯上調(diào);phoB、phoR基因的相對表達(dá)量在各菌株中幾乎不變。由此可見,低磷條件下,rhl系統(tǒng)在鼠李糖脂合成和調(diào)控中起關(guān)鍵作用,雙組份調(diào)控系統(tǒng)也參與了鼠李糖脂的調(diào)控;無磷條件下,rhl系統(tǒng)中的rhlR基因和las系統(tǒng)中的lasR基因在鼠李糖脂生物合成及基因表達(dá)調(diào)控中起主要作用,而雙組份調(diào)控系統(tǒng)不參與調(diào)控鼠李糖脂的合成;rsaL基因作為las系統(tǒng)的抑制子,會抑制鼠李糖脂的合成。因此,鼠李糖脂的合成及其基因表達(dá)調(diào)控受到了營養(yǎng)因素的影響;在不同磷酸鹽條件下,銅綠假單胞菌適應(yīng)環(huán)境的應(yīng)答機制有所差異,能直接或間接影響鼠李糖脂的合成。
[Abstract]:Rhamnolipid is one of attention in recent years because of the characteristics of biosurfactant, wide application range and environment friendly, make it become the synthetic surfactant potential alternatives. However, rhamnolipid production has low yield, small size and high cost, which greatly limits its use in industrial scale.. Pseudomonas aeruginosa (Pseudomonas aeruginosa) is one of the most ideal strains fermentation production of rhamnolipid biosynthesis, but its rhamnolipid by environmental factors, nutritional factors and complicated gene regulation, including gene expression and regulation of QS system (RHL system, Las system and PQS system) function is closely related to nutrition and environmental factors. In this study, Pseudomonas aeruginosa (Paerwginosa) PAO1 as the object, using Plackett-Burman (PB) design and response surface method (RSM) on the production of rhamnolipid The fermentation conditions were optimized.PB multi factor experimental design showed that phosphate concentration has significant effect, pH value and C/N ratio of 3 factors on rhamnolipid production, the most influential factor is the concentration of phosphate; through the RSM of the 3 significant factors of the optimal level of analysis, the results show that when the phosphate concentration was 1.71 g/L, pH value was 6, C/NL was 15.5, the strain PAO1 synthesis of rhamnolipid yield can be as high as 20.72 g/L, 64.05% higher than before the rhamnolipid production optimization of 12.63 g/L, very close to the theoretical prediction value of 21.35 g/L. on the basis of this, select the most significant factors affecting phosphate concentration, influence of phosphate concentration on bacteria PAO1 rhamnolipid synthesis, the results showed that when the concentration of phosphate was 0.01-0.5 g/L (i.e. low phosphorus concentration), the rhamnolipid yield than the optimal level of phosphate concentration when the high yield; especially when phosphate The concentration of 0.5 g/L, the highest rhamnolipid yield reached 24.93 g/L., but when the culture medium does not contain phosphate, rhamnolipid yield only 16.86 g/L. blood agar experiments showed that in phosphate concentration was 0.5 g/L hemolysis of the largest circle and rhamnolipid yield consistent results; analysis showed that strain PA01 had the corresponding differences in protein expression at different concentration of phosphate by SDS-PAGE gel electrophoresis. By using qPCR method of RHL system with different concentration of phosphate, Las related gene and two-component regulatory system expression were determined. The results show: rhlI, rhlR, lasI, lasR, rsaL, phoB, the relative expression of phoR gene were significantly change. Thus, different concentration of phosphate has effects on Pseudomonas aeruginosa rhamnolipid synthesis and gene expression. In order to further explore the Pseudomonas aeruginosa in acid salt under different phosphorus concentration The effects of rhamnolipid synthesis, constructs the RHL system mutants (rlI, rhlR) and Las system mutant (delta lasI, Delta lasR, Delta rsaL), respectively. The expression of rhamnolipid in different phosphate concentrations and lipid yield and its related genes were studied. The results showed that under low phosphorus under the condition of delta rhlI and delta rhlR rhamnolipid yield (18.35 g/L and 16.04 g/L) compared to the yield of PA01 (24.93g/L) were decreased by 26.39% and 35.66%, rhamnolipid production changes of delta lasI and delta lassR is not obvious, especially the amount of AlasI synthesized under this condition (23.3 g/L) is almost the same with PA01 the yield, and the yield of rhamnolipid (rsaL 28.36g/L) than the PA01 yield increased by 13.88%.qPCR showed that RHL mutant rhlA, the relative expression of rhlB gene was low, but the rhlA Delta lasI and delta lasR, the expression of rhlB gene is not influenced, ArsaL rhlA, the relative expression of rhlB gene increased; RHL mutation system phoB bacteria and rsaL, the relative expression of phoR gene decreased the amount of AlasI and lasR in relative expression did not change significantly. In the absence of phosphorus conditions, Delta rhlR and delta lasR rhamnolipid yield (12.86g/L and 13.02 g/L) compared wild mushroom yield of PAO1 (16.86 g/L) were decreased by 15.79% and 22.78%, uniform production of rhamnolipid synthesis of ArhlI and lasI under this condition with the wild strain, and the yield of rsaL (20.12 g/L) than the PAO1 yield increased by 19.34%.qPCR showed that rhlA gene of delta tasR and delta rhlR, rhlB the relative expression was down regulated, while rsaL expression was significantly upregulated; phoB, the relative expression of phoR gene is almost unchanged in all strains. Thus, low phosphorus conditions, RHL system play a key role in rhamnolipid synthesis and regulation, two-component The regulation system is also involved in the regulation of rhamnolipid; no phosphorus conditions, lasR gene rhlR and LAS in RHL system of expression plays an important role in regulation of rhamnolipid biosynthesis and gene synthesis, and two-component regulation system is not involved in the regulation of rhamnolipid; rsaL gene as a suppressor of Las system. Inhibition of rhamnolipid synthesis. Therefore, synthesis and gene expression regulation of rhamnolipid was influenced by nutritional factors; in different phosphate conditions, Pseudomonas aeruginosa adaptive response mechanism of environment is different, can directly or indirectly affect the synthesis of rhamnolipid.

【學(xué)位授予單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q78;Q939.9

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本文編號：1651640