本文選題：人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶　切入點(diǎn)：綠色熒光蛋白　出處：《吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)》2017年02期 　論文類型：期刊論文

【摘要】：目的:構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒hTERT-P2A-EGFP,探討其在HEK293FT細(xì)胞中的表達(dá)和轉(zhuǎn)染效率。方法:利用pBABE-puro-hTERT和pRRLSIN-cPPT-MSCV-EGFP質(zhì)粒構(gòu)建重組質(zhì)粒。以該質(zhì)粒為模板采用PCR法獲取hTERT、P2A和EGFP基因,采用重疊PCR法獲得目的片段hTERT-P2A-EGFP,經(jīng)酶切后目的片段與真核表達(dá)載體pRRLSIN-cPPT-MSCV-EGFP連接,得到并鑒定含有hTERT-P2A-EGFP基因的重組質(zhì)粒。經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK293FT細(xì)胞,熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白(GFP)在細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果:PCR檢測目的基因hTERT、P2A和EGFP的片段長度分別為3 400、110和720bp。酶切后目的基因片段hTERT-P2A-EGFP約4 300bp。測序分析,目的基因1 547位點(diǎn)發(fā)生了突變。利用定點(diǎn)突變技術(shù)成功誘變,再次測序后目的基因序列與GenBank公布的基因序列完全一致。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293FT細(xì)胞后在熒光顯微鏡下可以觀察到GFP。流式細(xì)胞術(shù)檢測,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293FT細(xì)胞的效率為44.8%。結(jié)論:成功構(gòu)建攜帶目的基因hTERT-P2A-EGFP的重組質(zhì)粒,且可用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。
[Abstract]:Aim: to construct the eukaryotic expression plasmid hTERT-P2A-EGFP, and to investigate its expression and transfection efficiency in HEK293FT cells. Methods: the recombinant plasmid was constructed by using pBABE-puro-hTERT and pRRLSIN-cPPT-MSCV-EGFP plasmids. HTERT-P2A and EGFP genes were obtained by PCR using the plasmid as template. The target fragment hTERT-P2A-EGFP was obtained by overlapping PCR method and ligated with eukaryotic expression vector pRRLSIN-cPPT-MSCV-EGFP. The recombinant plasmid containing hTERT-P2A-EGFP gene was obtained and identified. The recombinant plasmid was transfected into HEK293FT cells by liposome-mediated recombinant plasmid. Results the length of the target gene hTERT P2A and EGFP were 3 400,110 and 720 bp. the target gene hTERT-P2A-EGFP was about 4 300 BP. Objective Gene mutation occurred at 1 547 locus. Site-directed mutagenesis was successfully used. After re-sequencing, the sequence of the target gene was identical to that published by GenBank. After transfection of the recombinant plasmid into HEK293FT cells, GFP-flow cytometry was observed under fluorescence microscope. Conclusion: the recombinant plasmid carrying the target gene hTERT-P2A-EGFP can be successfully constructed and can be used for cell transfection.
【作者單位】： 吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室;吉林大學(xué)第一醫(yī)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院;吉林大學(xué)免疫學(xué)研究所;
【基金】：國家自然科學(xué)基金資助課題(81202379)
【分類號(hào)】：Q78

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本文編號(hào)：1641463