本文選題：石磺　切入點：表達分析　出處：《上海海洋大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：進化論觀點認為生命起源于海洋,生物從水棲向陸棲進化,兩棲類是進化過程中產(chǎn)生的過渡態(tài)物種。石磺科(Onchidiidae)貝類,隸屬于軟體動物門(Mollusca)、腹足綱(Gastropoda)、肺螺亞綱(Pulmonata)、縮眼目(Systellommatophora),其幼蟲生活在水中,變態(tài)發(fā)育后具有明顯的兩棲性,被認為是無脊椎動物由淺海向陸地進化的過渡類群,具有重要的學術價值。我國華東地區(qū)分布著瘤背石磺(Onchidium struma)、平疣桑椹石磺(Platevindex mortoni)、里氏擬石磺(Paraoncidium reevesii)和紫色疣石磺(Peronia verruculata),生存環(huán)境由潮間帶向潮上帶遷移,產(chǎn)生出具有時空代表性的表型差異。本論文依據(jù)石磺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,開發(fā)出四種石磺間表型進化相關基因,Os-NMHC,Os-RYR,Os-IP3R,Os-MEK,Os-IP3K的cDNA序列,通過RT-PCR技術探究基因的種間差異表達趨勢,從基因表達水平探究石磺表型進化差異的同時,也初步地探究了NMHC基因亞型進化節(jié)點問題以及相似鈣調(diào)蛋白RYR和IP3R基因的進化趨勢。首次于石磺科貝類中克隆出一條差異表達的Ⅱ型非肌肉型肌球蛋白重鏈基因(NMHCⅡ)的cDNA全長,將其命名為Os-NMHC基因。其序列全長6057bp,包括5733bp的開放閱讀框,236bp的5’端非翻譯區(qū),88bp的3’端非翻譯區(qū),共編碼1910個氨基酸;預測蛋白質(zhì)等電點為5.26,相對分子質(zhì)量為220.46KD;通過Phyre2程序和Pymol軟件構(gòu)建蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)圖,預測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)以α螺旋和β折疊為主;通過Clustalx和dnaMAN軟件進行氨基酸序列比對,發(fā)現(xiàn)其與爪蟾NMHC II A序列一致度為60.37%,與爪蟾NMHC II B序列相似度為61.47%;通過Bayes軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,發(fā)現(xiàn)其與加州海兔親緣關系最近。通過QRT-PCR技術檢測,發(fā)現(xiàn)該基因在四種石磺的背部、腹部、腹足部、肺囊、心臟、神經(jīng)節(jié)中均有不同程度的表達。種間表達水平與進化趨勢相一致,依次為:瘤背石磺≥平疣桑椹石磺里氏擬石磺紫色疣石磺。對于石磺Os-NMHC基因的研究,將有助于NMHC亞型進化節(jié)點問題的探究,并為石磺科貝類由淺海向濕地進化的機制研究提供新視角。RYR和IP3R是兩種結(jié)構(gòu)相似、功能相近的鈣調(diào)蛋白,通過RACE技術于瘤背石磺中開發(fā)出Os-RYR和Os-IP3R的cDNA3’末端保守區(qū)序列。Os-RYR核酸序列1253bp,包括83bp的3’非編碼區(qū),翻譯氨基酸殘基376個,與加州海兔RYR末端保守區(qū)序列一致度為94%。Os-IP3R核酸序列4574bp,包括1561bp的3’非編碼區(qū),翻譯936個氨基酸殘基,與加州海兔IP3R末端保守區(qū)序列一致度為85%。Clustal omega在線比對,Os-RYR和Os-IP3R鈣離子通道在GXRXGGGXGD處的序列高度保守,證明該序列對于形成離子通道具有重要作用。Os-IP3R離子通道保守區(qū)與加州海兔IP3R離子通道保守區(qū)序列相似度為94%,蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)重合度極高。QRT-PCR分析結(jié)果顯示,Os-RYR和Os-IP3R在紫色疣石磺中表達水平均最低,Os-RYR在石磺物種間的表達水平不具有梯度趨勢,Os-IP3R在瘤背石磺、平疣桑椹石磺、紫色疣石磺中表達量呈梯度下降趨勢。Os-IP3R/Os-RYR表達百分比在紫色疣石磺、平疣桑椹石磺、瘤背石磺中呈梯度上升趨勢,說明功能相同結(jié)構(gòu)相似的兩種鈣調(diào)蛋白基因Os-IP3R和Os-RYR,在石磺由淺海向濕地進化過程中,對Os-IP3R的鈣調(diào)功能呈現(xiàn)增加的趨勢,其表達具有一定得趨向性。以高等動物VEGF信號通路分子為基礎,結(jié)合石磺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,認為石磺中VEGF信號通路(血管內(nèi)皮生長因子信號通路)中不存在IP3K/AKT和mTOR通路途徑,并篩選出與鈣調(diào)蛋白Os-IP3R具有互作關系的Os-IP3K通路分子以及表皮生長相關的下游通路分子Os-MEK。克隆瘤背石磺Os-MEK核酸序列全長1201bp,包括40bp 5’的非編碼區(qū)和83bp的3’非編碼區(qū),共編碼368個氨基酸殘基,與加州海兔MEK基因編碼氨基酸序列一致度達到82%。Os-MEK蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)包括α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和少量無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)�？寺s-IP3K核酸序列全長3661bp,不包括3’和5’端非編碼區(qū),編碼721個氨基酸殘基。RT-PCR分析結(jié)果顯示Os-IP3K在瘤背石磺各組織中的表達趨勢與Os-IP3R表達趨勢一致。在平疣桑椹石磺神經(jīng)節(jié)中不表達Os-IP3R,但是Os-IP3K的表達水平卻是各組織中最高的。提示功能相關的通路分子Os-IP3R和Os-IP3K在石磺科不同物種間的互作功能有所不同,對于石磺科貝類信號通路分子的開發(fā)和表達分析以及通路進化研究具有重要意義。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：上海海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S917.4

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本文編號：1633208