本文選題：Shp2　切入點(diǎn)：條件性基因敲除　出處：《浙江大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景：Shp2對(duì)多種神經(jīng)系統(tǒng)組織器官和細(xì)胞類型的發(fā)育及功能具有重要調(diào)控作用。放射狀膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的重要功能近年來被逐漸發(fā)現(xiàn),目前對(duì)于Shp2在放射狀膠質(zhì)細(xì)胞中的功能尚不清楚。受人神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(hGFAP)啟動(dòng)子調(diào)控的Cre重組酶表達(dá)于放射狀膠質(zhì)細(xì)胞中,是放射狀膠質(zhì)細(xì)胞條件性基因敲除的有力工具。因此,培育并研究基于hGFAP啟動(dòng)子的Shp2條件性敲除小鼠對(duì)于揭示調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和功能的分子機(jī)制具有重要意義。研究目的：(1)培育并鑒定基于hGFAP啟動(dòng)子的Shp2條件性基因敲除小鼠(2)觀察并研究Shp2條件性敲除對(duì)幼鼠生存、生長及軀體感覺運(yùn)動(dòng)功能發(fā)育的影響(3)研究Shp2條件性敲除對(duì)幼鼠大腦皮質(zhì)、小腦及腦干組織結(jié)構(gòu)的影響并初步探討相關(guān)分子機(jī)制研究方法：本研究通過hGFAP-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠和Shp2flox/flox基因打靶小鼠交配產(chǎn)生hGFAP-Cre/Shp2flox/flox小鼠,即Shp2條件性敲除小鼠。通過基因鑒定、Real-time PCR、Western blot及免疫組化等方式對(duì)Shp2條件性敲除小鼠進(jìn)行多方面的鑒定。觀察記錄Shp2條件性敲除小鼠的外觀、生存時(shí)長、出生后體重及大腦重量增長情況,并通過自主回巢實(shí)驗(yàn)、循聲運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)、軀體自主翻正實(shí)驗(yàn)及抓桿實(shí)驗(yàn)評(píng)估Shp2條件性敲除幼鼠的感覺運(yùn)動(dòng)功能的發(fā)育情況。采用石蠟切片H-E、甲苯胺藍(lán)染色對(duì)Shp2條件性敲除小鼠的大腦皮質(zhì)、小腦及腦干進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)學(xué)觀察,并通過免疫組化、免疫熒光對(duì)Shp2條件性敲除小鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞增殖、凋亡的情況以及大腦皮質(zhì)、小腦、腦干神經(jīng)元細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量的分布情況進(jìn)行觀察。最后本研究通過Western blot實(shí)驗(yàn)對(duì)Shp2條件性敲除小鼠大腦皮質(zhì)中Akt,Erk信號(hào)通路蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)。研究結(jié)果：第一部分經(jīng)hGFAP-Cre小鼠和S hp2flox/flox小鼠交配成功培育出Shp2條件性敲除小鼠。Shp2條件性敲除小鼠在腦組織中檢測(cè)出敲除特征性序列,且腦組織中Shp2的mRNA、蛋白表達(dá)水平顯著下降。第二部分Shp2條件性敲除幼鼠體形減小,體重及腦重增長遲滯,壽命縮短。Shp2條件性基因敲除幼鼠自主回巢能力、循聲運(yùn)動(dòng)能力、自主翻正能力及抓桿能力顯著下降。第三部分Shp2條件性基因敲除小鼠大腦皮質(zhì)面積、厚度減小,大腦皮質(zhì)神經(jīng)元減少、星形膠質(zhì)細(xì)胞比例增多、伴有皮質(zhì)細(xì)胞凋亡增加、腦室區(qū)細(xì)胞增殖下降及Erk信號(hào)通路抑制。此外Shp2條件性敲除小鼠的小腦、腦干組織結(jié)構(gòu)產(chǎn)生病理改變。結(jié)論：本研究成功培育基于hGFAP啟動(dòng)子的Shp2條件性基因敲除小鼠。研究結(jié)果表明放射狀膠質(zhì)細(xì)胞中的Shp2對(duì)于幼鼠大腦皮質(zhì)、小腦及腦干的正常結(jié)構(gòu)功能的發(fā)育具有重要作用。
[Abstract]:Background: Shp2 plays an important role in regulating the development and function of various nervous system tissues, organs and cell types. The important functions of radial glial cells in the central nervous system have been gradually discovered in recent years. At present, the function of Shp2 in radial glial cells is not clear. The Cre recombinant enzyme regulated by human glial fibrillary acidic protein (GFAP) promoter is expressed in radiative glial cells. Is a powerful tool for radiative glial conditional gene knockout. It is important to cultivate and study Shp2 conditional knockout mice based on hGFAP promoter in order to reveal the molecular mechanism of regulating the development and function of central nervous system. Objective: to cultivate and identify the Shp2 conditionality based on hGFAP promoter. To observe and study the survival of Shp2 conditional knockout on young mice. Effects of growth and somatosensory motor function on the cortical effects of Shp2 conditioned knockout in young rats. The effects of cerebellum and brainstem on the structure of cerebellum and brainstem and preliminary study on the molecular mechanism: in this study, hGFAP-Cre/Shp2flox/flox mice were produced by mating between hGFAP-Cre transgenic mice and Shp2flox/flox gene targeting mice. The Shp2 conditional knockout mice were identified in many ways by means of gene identification and immunohistochemistry. The appearance of Shp2 conditioned knockout mice was observed and recorded, and the survival time of Shp2 conditional knockout mice was observed and recorded. The body weight and brain weight increased after birth, and through the self-homing experiment, the acoustic movement experiment, To evaluate the development of sensorimotor function in Shp2 conditioned knockout mice, somatic autonomic righting test and rod grabbing test were used. H-E paraffin sections and toluidine blue staining were used to treat the cerebral cortex of Shp2 conditioned knockout mice. The histomorphology of cerebellum and brainstem was observed, and the proliferation and apoptosis of cerebral cortex cells and neurons in cerebral cortex, cerebellum and brainstem of Shp2 conditioned knockout mice were observed by immunohistochemistry and immunofluorescence. The distribution of astrocytes was observed. Finally, the expression of Akttnerk signaling pathway protein in the cerebral cortex of Shp2 conditioned knockout mice was detected by Western blot experiment. After mating between hGFAP-Cre mice and S hp2flox/flox mice, Shp2 conditioned knockout mice. Shp2 conditional knockout mice were successfully bred to detect knockout characteristic sequences in brain tissue. In the second part, the body shape of Shp2 conditioned knockout mice was decreased, the body weight and brain weight of the knockout mice were delayed, the life span was shortened. Shp2 conditioned gene knockout mice had the ability to homing autonomously and to follow the sound. In the third part, the area and thickness of cerebral cortex of Shp2 conditioned gene knockout mice decreased, the number of cortical neurons decreased, the proportion of astrocytes increased, and the apoptosis of cortical cells increased. The cell proliferation in the ventricular area decreased and the Erk signaling pathway was inhibited. In addition, the cerebellum of Shp2 conditioned knockout mice was removed. Conclusion: Shp2 conditional gene knockout mice based on hGFAP promoter were successfully cultured in this study. The results showed that Shp2 in radial glia cells affected the cerebral cortex of young rats. The development of normal structure and function of cerebellum and brain stem plays an important role.
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R741

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