發(fā)布時(shí)間：2018-03-14 09:14

  本文選題：Tsc1　切入點(diǎn)：mTORC1　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：一、研究背景Tsc1和Tsc2基因的名字來源于結(jié)節(jié)性硬化癥(Tuberous sclerosis complex, Tsc),這是一種嚴(yán)重的常染色體顯性遺傳疾病,當(dāng)Tsc1和Tsc2中的一個(gè)或兩個(gè)基因發(fā)生突變就會造成結(jié)節(jié)性硬化癥(TSC)。結(jié)節(jié)性硬化癥(TSC)的特點(diǎn)是多個(gè)器官和組織,包括真皮,平滑肌,腎和神經(jīng)系統(tǒng)形成錯(cuò)構(gòu)瘤。正由于Tsc1和Tsc2基因突變會帶來嚴(yán)重的后果,這兩個(gè)基因的功能受到了廣泛的關(guān)注和研究。由Tsc1基因編碼的hamartin蛋白質(zhì)和由Tsc2基因編碼的tuberin蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)共同形成功能性異二聚體(TSC1/TSC2復(fù)合物),該復(fù)合物具有GTP酶激活蛋白(GAP)活性,在控制細(xì)胞大小,細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖的信號通路中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。TSC1和TSC2蛋白通過它們各自的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域相互結(jié)合。TSC2蛋白質(zhì)的C-末端含有GAP結(jié)構(gòu)域,而TSC1蛋白則負(fù)責(zé)保護(hù)TSC2蛋白不受泛素介導(dǎo)的降解。研究表明,當(dāng)在果蠅體內(nèi)突變失活Tsc1或Tsc2中任一個(gè)基因,所引起的表型是相同的。因此,干擾或敲除Tsc1或Tsc2中的任何一個(gè),都能有效抑制TSC1/TSC2復(fù)合物發(fā)揮生物學(xué)作用。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)是一種絲氨酸-蘇氨酸激酶,屬于磷脂激酶相關(guān)激酶家族,它是TSC1/TSC2復(fù)合物的重要下游靶分子。mTOR主要以兩種蛋白復(fù)合物的形式存在于細(xì)胞中并發(fā)揮激酶活性：mTOR復(fù)合物1 (mTOR complex 1, mTORC1)和mTOR復(fù)合物2 (mTORcomplex 2, mTORC2)。mTORC1由rnTOR以及4個(gè)調(diào)節(jié)蛋白：Raptor、PRAS40、 mLST8和DEPTOR共同構(gòu)成。其所介導(dǎo)的信號通路負(fù)責(zé)接收作用于細(xì)胞的營養(yǎng)、能量、應(yīng)激等信號,調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)翻譯,進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞生長、增殖與自噬。小GTP酶Rheb (Ras-homology enriched in brain)是mTORC1的直接上游激活蛋白,而Rheb的活性由TSC1/TSC2復(fù)合物控制。TSC1/TSC2復(fù)合物與GTP結(jié)合狀態(tài)的Rheb結(jié)合,并將GTP水解,轉(zhuǎn)為GDP結(jié)合狀態(tài)的Rheb喪失激酶活性,無法激活其下游的mTORC1。因此,TSC1/TSC2復(fù)合物實(shí)際上發(fā)揮著抑制mTORC1活性的作用。當(dāng)營養(yǎng)、能量等信號刺激時(shí),TSC1/TSC2復(fù)合物被磷酸化,導(dǎo)致它們與Rheb的結(jié)合被解除,Rheb的激酶活性恢復(fù),進(jìn)而激活mTORC1。當(dāng)Tsc1或Tsc2基因缺失時(shí),也就失去了TSC1/TSC2復(fù)合物對Rheb活性的抑制,從而導(dǎo)致mTORC1持續(xù)性激活。S6K和4EBP-1是位于mTORC1下游的兩個(gè)重要效應(yīng)蛋白,他們所調(diào)控的信號通路都與促進(jìn)蛋白質(zhì)合成有關(guān),因而在細(xì)胞生長方面發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。其中,S6K被mTORC1磷酸化激活后,可進(jìn)一步磷酸化下游的核糖體蛋白S6,磷酸化的S6(p-S6)促進(jìn)核糖體蛋白合成。因此,p-S6通常被視為mTORC1活化的指標(biāo)。除了mTORC1, AKT也是調(diào)控細(xì)胞增殖與存活的重要蛋白。為了控制細(xì)胞的有序生長與增殖,促進(jìn)細(xì)胞生長的信號不能被無限放大。因此,在mTORC1和AKT之間存在著負(fù)反饋調(diào)節(jié)。mTORC1激活的S6K一方面磷酸化S6促進(jìn)蛋白質(zhì)翻譯,另一方面則通過磷酸化胰島素受體底物-1(IRS-1)而破壞IRS-1與胰島素受體或胰島素樣生長因子受體的結(jié)合,從而使胰島素或胰島素樣生長因子信號不能正常傳遞到AKT分子,進(jìn)而抑制AKT活性。這條負(fù)反饋調(diào)節(jié)通路在控制細(xì)胞生長和增殖方面起到重要的作用。組織和器官發(fā)育需要適當(dāng)?shù)募?xì)胞生長,增殖和凋亡,由此可推斷mTORC1信號在組織器官發(fā)育中必定發(fā)揮著重要作用。然而,Tscl或Tsc2基因全身敲除的胚胎致死性阻礙了人們對mTORC1信號在組織器官發(fā)育中的作用的研究。在一些重要組織器官——比如乳腺的發(fā)育中,mTORC1信號起著怎樣的作用尚未闡明。我們的研究采用Cre-LoxP系統(tǒng)建立乳腺管腔乳腺上皮細(xì)胞特異性敲除Tscl的小鼠模型,這種小鼠能夠正常出生、成長、進(jìn)入性成熟期,是研究mTORC1信號與乳腺發(fā)育的理想模型。有趣的是,我們的研究發(fā)現(xiàn)敲除小鼠乳腺上皮細(xì)胞Tsc1基因后,并沒有如預(yù)期般造成乳腺上皮細(xì)胞過度增生,反而明顯抑制了小鼠乳腺導(dǎo)管的發(fā)育。進(jìn)一步的研究證明,適度的mTORC1活性對于青春期小鼠乳腺發(fā)育的極為重要。二、研究方法利用LoxP-flanked Tsc1 (Tsc1L/L)小鼠及MMTVCre+小鼠雜交構(gòu)建乳腺上皮細(xì)胞特異性敲除Tsc1的模型小鼠(Tsc1L/LLMMTVCre+);通過Tsc1L/wt小鼠與MMTVCre+小鼠雜交獲得Tscl未被敲除的Tsc1wt/wtMMTVCre+小鼠作為正常對照。小鼠于出生后4-6周處死,取第4對乳腺脂肪墊通過全乳腺包埋染色(Whole mount staining)觀察乳腺發(fā)育情況,在高倍鏡下計(jì)數(shù)乳腺二級導(dǎo)管數(shù)量及終末腺泡(TEB)數(shù)量。利用BrdU法檢測乳腺上皮細(xì)胞增殖,利用TUNEL法檢測乳腺上皮細(xì)胞凋亡。通過免疫組織化學(xué)法檢測乳腺上皮TSC1、p-S6、p-PDK1、 p-AKT (ser308)、p-AKT (ser473)、IRS-1、ERa、cyclin D1、cyclin E、CDK4、 CDK2、p-Rb及p27kip1的表達(dá)。雷帕霉素逆轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)：4周大的小鼠給予腹腔注射雷帕霉素0.1 mg/kg,每2天1次,連續(xù)2周；取相同基因型相同周齡的小鼠腹腔注射生理鹽水作為對照。2周后處死小鼠,進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)。三、研究結(jié)果1.成功建立了乳腺上皮特異性敲除Tsc1基因的小鼠模型；2.Tsc1基因敲除抑制小鼠乳腺導(dǎo)管發(fā)育,使小鼠乳腺上皮細(xì)胞增殖降低而凋亡增加；3.Tsc1基因敲除乳腺上皮細(xì)胞的p-S6表達(dá)上調(diào),mTORC1抑制劑雷帕霉素可逆轉(zhuǎn)該小鼠乳腺p-S6的上調(diào)并一定程度上恢復(fù)乳腺導(dǎo)管發(fā)育,說明mTORC1活性增高導(dǎo)致該小鼠乳腺發(fā)育障礙；同時(shí),相同劑量的雷帕霉素作用于正�；蛐托∈笠惨鹑橄賹�(dǎo)管發(fā)育障礙,提示適當(dāng)?shù)膍TORC1活性對乳腺正常發(fā)育至關(guān)重要；4.Tsc1基因敲除乳腺上皮細(xì)胞的AKT蛋白活性下調(diào),該下調(diào)可被雷帕霉素逆轉(zhuǎn),提示mTORC1持續(xù)激活對AKT的負(fù)反饋抑制可能是導(dǎo)致乳腺上皮細(xì)胞增殖抑制、凋亡增加的機(jī)制之一；5.Tscl基因敲除抑制乳腺上皮細(xì)胞的ERa及IRS-1的核內(nèi)表達(dá)下調(diào),該下調(diào)可被雷帕霉素逆轉(zhuǎn),提示ERa的核內(nèi)信號通路被抑制可能是Tscl基因敲除導(dǎo)致乳腺發(fā)育障礙的機(jī)制之一；6.Tsc1基因敲除乳腺上皮的細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1,Cyclin E, CDK2及CDK4的表達(dá)下調(diào),該下調(diào)可被雷帕霉素逆轉(zhuǎn),提示Tscl基因敲除可能通過下調(diào)細(xì)胞周期蛋白表達(dá)抑制乳腺上皮細(xì)胞增殖,從而導(dǎo)致乳腺導(dǎo)管發(fā)育障礙。四、研究結(jié)論。綜上所述,本課題研究敲除Tsc1基因在小鼠乳腺導(dǎo)管發(fā)育中的作用,發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)膍TORC1活性對小鼠青春期乳腺導(dǎo)管的發(fā)育至關(guān)重要。mTORC1持續(xù)激活或者活性不足都會導(dǎo)致青春期小鼠乳腺導(dǎo)管發(fā)育障礙。Tscl基因敲除導(dǎo)致乳腺發(fā)育受阻的分子機(jī)制可能包括：1,mTORC1的持續(xù)性激活負(fù)反饋抑制AKT活性,從而使乳腺上皮細(xì)胞增殖抑制,凋亡增加；2,通過抑制ERα的核信號通路抑制乳腺上皮細(xì)胞增殖;3,通過下調(diào)乳腺上皮細(xì)胞細(xì)胞核中Cyclin D1, Cylin E, CDK2和CDK4的表達(dá),阻止細(xì)胞周期進(jìn)程。我們推測,ERa, cyclin D1, cyclin E, CDK2和CDK4的表達(dá)下調(diào)均與AKT活性降低有關(guān)。mTORC1的持續(xù)性激活所導(dǎo)致的AKT活性下降在Tsc1敲除誘導(dǎo)的乳腺發(fā)育障礙中應(yīng)該起到了關(guān)鍵作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R596.1

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本文編號：1610557