本文選題：乙肝病毒　切入點：基因編輯技術(shù)　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染會引起慢性肝炎、肝硬化及細(xì)胞癌等肝臟疾病,全球每年約有100萬人死于乙肝病毒感染引起的肝臟疾病。雖然乙肝疫苗的廣泛應(yīng)用在很大程度上預(yù)防了乙肝病毒的傳播,然而慢性乙肝的治療一直處于困境。目前公認(rèn)有效的治療藥物主要為核苷酸類似物,但核苷酸類似物僅能暫時降低患者血清中的病毒載量,甚至有停藥后再度暴發(fā)的風(fēng)險。這主要是因為目前臨床上的治療方法均不能清除乙肝慢性感染和復(fù)發(fā)的根源,也就是肝細(xì)胞內(nèi)乙肝病毒的共價閉合環(huán)狀DNA(ccc DNA)和HBV在復(fù)制過程中整合至宿主細(xì)胞基因組上的整合狀態(tài)HBV DNA。因此,探尋從根本上清除HBV的方法成為治療慢性乙肝的當(dāng)務(wù)之急。近年來基于細(xì)菌獲得性免疫系統(tǒng)CRISPR開發(fā)出的CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)幾乎可以對任何物種進(jìn)行DNA的精確編輯,這一方便、快捷的技術(shù)使得從根本上清除HBV ccc DNA和整合狀態(tài)的HBV DNA成為了可能。在本研究中,我們首先利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)在HBV細(xì)胞模型以及HBV小鼠模型中實現(xiàn)了對乙肝病毒復(fù)制根源HBV ccc DNA的靶向剪切以及對乙肝病毒復(fù)制與表達(dá)的高效抑制。隨后,我們又利用該技術(shù)在清除HBV ccc DNA的同時,完全清除了HBV細(xì)胞模型中全長整合的HBV基因組,實現(xiàn)了對感染細(xì)胞中HBV更加徹底的清除。最后,為了檢測CRISPR-Cas9在清除HBV過程中對細(xì)胞基因組造成的影響,我們利用全基因組測序技術(shù)評估了感染及清除HBV前后宿主細(xì)胞基因組的變化,并首次發(fā)現(xiàn)了宿主細(xì)胞基因組上有大量SNP會隨著HBV的清除而恢復(fù)至HBV感染前的類型。1.CRISPR-Cas9抑制HBV復(fù)制與表達(dá)的研究(1)剪切HBV DNA的高效gRNA靶點篩選由于HBV基因組變異位點較多,開放閱讀框高度重疊,且宿主細(xì)胞中存在多種形式的HBV DNA,為了篩選出能夠高效剪切HBV基因組的g RNA靶點,我們通過生物信息學(xué)比對以及對CRISPR-Cas9剪切活性的檢測,從8個候選g RNA中篩選出了對HBV DNA剪切及抑制效率最高的g RNA-S4靶點。通過深度測序,我們證實了該系統(tǒng)對HBV基因組的剪切作用并評估了該系統(tǒng)的剪切效率。(2)利用gRNA-S4系統(tǒng)高效抑制細(xì)胞及小鼠體內(nèi)HBV的復(fù)制與表達(dá)我們利用HBV穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系Hep G2.A64以及HBV高壓水動力小鼠分別作為模型,分別檢測了g RNA-S4在體內(nèi)、外對HBV復(fù)制的抑制效果。結(jié)果顯示,g RNA-S4在細(xì)胞中高效抑制了HBV復(fù)制與表達(dá)并將HBV ccc DNA含量降低了95.37±0.64%。我們還利用該系統(tǒng)將HBV高壓水動力小鼠血清中的HBs Ag含量降低了99.92±0.04%,將小鼠血清中的HBV DNA降至了陰性臨界值以下。(3)CRISPR-Cas9靶向HBV的特點分析在上述實驗中,由于細(xì)胞中存在多種形式的HBV DNA,其中環(huán)狀HBV DNA在CRISPR-Cas9剪切后即降解。因此,我們在研究中發(fā)現(xiàn)CRISPR-Cas9對細(xì)胞中HBV的剪切效率實際上要遠(yuǎn)低于對HBV表達(dá)的抑制效率。此外,由于HBV基因組編碼區(qū)的高度重疊,我們僅用破壞一個位點便可抑制HBV全部基因的表達(dá)。2 CRISPR-Cas9清除整合狀態(tài)HBV DNA的研究HBV在感染過程中會將病毒基因組整合到宿主細(xì)胞染色體上,而這些整合的HBV DNA被認(rèn)為是肝細(xì)胞癌發(fā)生的重要因素,會引起宿主基因組的變異進(jìn)而改變細(xì)胞增殖與分化相關(guān)基因的表達(dá)。同時,實驗室常用的HBV轉(zhuǎn)基因細(xì)胞模型中除了含有HBV ccc DNA均整合有HBV的全長基因組,且全長整合的HBV DNA是穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞模型中HBV復(fù)制與表達(dá)的主要模板。因此,為了實現(xiàn)對HBV感染的清除,除了靶向降解HBV ccc DNA之外,我們還必須清除細(xì)胞染色體上全長整合的HBV DNA。由于HBV穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中的乙肝病毒生活周期及復(fù)制模式與實際情況類似,均存在HBV ccc DNA和HBV復(fù)制中間體等多種形式的HBV DNA。因此利用CRISPR-Cas9在HBV穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞模型中清除全長整合的HBV DNA同樣能夠很好地模擬真實感染中清除HBV DNA整合片段的過程。(1)建立了特異性擴增HBV穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中全長整合HBV DNA的新方法由于HBV細(xì)胞模型中HBV整合位點較多,且細(xì)胞內(nèi)存在多種形式的HBV DNA,利用Alu-PCR以及細(xì)胞全基因組測序均難以定位出全長整合HBV基因組的具體位置。在本部分實驗中,我們建立了一種特異性擴增HBV穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞模型中全長整合HBV基因組的新方法,即利用HBV全長整合位點3’端外源啟動子特異性引物,實現(xiàn)對細(xì)胞基因組中全長整合HBV基因組的擴增。(2)首次清除HBV穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中全長整合的HBV DNA我們利用靶向全長整合HBV基因組兩端側(cè)翼序列的gRNA-69系統(tǒng)成功清除了細(xì)胞中全長整合的HBV基因組。在清除細(xì)胞中全長整合的HBV DNA后,細(xì)胞中的HBV ccc DNA、HBs Ag、HBe Ag、HBV DNA在連續(xù)300天的培養(yǎng)中均無法檢出。這部分結(jié)果表明,我們首次利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)清除了細(xì)胞內(nèi)的HBV感染。3清除HBV前后宿主細(xì)胞全基因組測序及分析(1)清除HBV感染后細(xì)胞基因組中HBV整合位點大量消失為了探究CRISPR-Cas9在清除HBV的過程中對宿主細(xì)胞基因組可能造成的影響,我們對HBV清除前后的細(xì)胞株以及HBV整合前的Hep G2細(xì)胞株分別進(jìn)行了全基因組測序。通過對3株細(xì)胞HBV整合位點的分析,我們發(fā)現(xiàn)相比清除HBV前的細(xì)胞Hep G2.A64,清除了HBV后的69-7細(xì)胞基因組中HBV的隨機整合位點減少了97.7%。(2)清除HBV感染后細(xì)胞基因組中大量SNP恢復(fù)至HBV感染前狀態(tài)通過對HBV感染及清除前后3個細(xì)胞基因組上突變尤其是SNP的分析,我們發(fā)現(xiàn),HBV感染后的A64細(xì)胞中共有2,284,202個SNP位點發(fā)生了變異,而其中的2,093,238的SNP位點在HBV被清除后恢復(fù)成了HBV感染前的狀態(tài)。(3)排除CRISPR-Cas9脫靶效應(yīng)及細(xì)胞污染的可能性為了進(jìn)一步探究清除HBV感染后宿主細(xì)胞基因組突變恢復(fù)的原因,我們首先利用同源序列分析了g RNA的脫靶效應(yīng),證實了g RNA-69不存在明顯的脫靶效應(yīng)。然后通過對HBV整合位點的分析,證實了清除HBV后的69-7細(xì)胞并非此前HBV感染細(xì)胞A64中污染的Hep G2細(xì)胞。最后通過對g RNA-69剪切后的殘余序列進(jìn)一步分析,證實了清除HBV后的69-7細(xì)胞并非g RNA-69轉(zhuǎn)染之前存在于A64細(xì)胞中的亞克隆,而是g RNA-69剪切A64細(xì)胞中HBV后所形成的細(xì)胞克隆。這部分結(jié)果否定了細(xì)胞基因組突變的恢復(fù)與CRISPR-Cas9的脫靶及細(xì)胞污染有關(guān)。(4)清除HBV感染后細(xì)胞基因組突變恢復(fù)的原因分析通過對HBV感染及清除前后細(xì)胞基因組SNP類型變化情況的分析結(jié)果以及宿主細(xì)胞DNA修復(fù)通路中RAD51基因表達(dá)量的檢測結(jié)果我們推測,這種雜合SNP的恢復(fù)或許是由于存在同源修復(fù)模板,進(jìn)而在DNA修復(fù)系統(tǒng)的參與下實現(xiàn)的恢復(fù)。本次研究中,我們利用CRISPR-Cas9技術(shù)首次實現(xiàn)了對宿主細(xì)胞內(nèi)乙肝病毒感染的清除,深入分析了CRISPR-Cas9在清除HBV過程中的脫靶效應(yīng)、抑制效率以及作用時間。在清除了HBV感染后的細(xì)胞基因組中,我們還觀察到了大量HBV的整合位點以及宿主細(xì)胞基因組變異會隨著HBV的清除而恢復(fù)。本次研究展現(xiàn)了CRISPR-Cas9技術(shù)在根治慢性乙肝以及阻斷其向肝細(xì)胞癌發(fā)展方面的巨大潛力。此外,清除HBV感染后宿主細(xì)胞基因組上的新發(fā)現(xiàn)也將為今后進(jìn)一步研究乙肝病毒與宿主基因組的相互作用以及乙肝病毒致癌機制提供新的線索。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R512.62

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本文編號：1596700