本文選題：膀胱腫瘤　切入點(diǎn)：尿素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白　出處：《吉林大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：膀胱癌為泌尿生殖系統(tǒng)中較為常見的惡性腫瘤。據(jù)美國癌癥協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì),2016年,全美新發(fā)膀胱癌將達(dá)76,960例,新增死亡病例為16,390例。膀胱癌的首發(fā)癥狀為無痛性血尿,約有75%的患者,在首診時(shí)被診斷為非肌層浸潤性移行上皮癌。在接受首次標(biāo)準(zhǔn)化的經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)后(TURBT),約有70%的患者將會(huì)在5年內(nèi)復(fù)發(fā)。因此,對(duì)于膀胱癌的患者,在術(shù)后需經(jīng)歷嚴(yán)格復(fù)查程序,包括定期的膀胱鏡檢查,以及對(duì)于高腫瘤分級(jí)患者術(shù)后的膀胱內(nèi)輔助化療和免疫治療。這使得患者在承受疾病的痛苦同時(shí),也背負(fù)了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。有關(guān)膀胱腫瘤的分子生物學(xué)機(jī)制一直是科學(xué)研究的重點(diǎn)。目前,受到關(guān)注的研究方向包括9號(hào)染色的缺失,成纖維細(xì)胞生長因子受體3(FGFR3)的點(diǎn)突變,以及抑癌基因P53和Rb的相關(guān)改變。然而腫瘤的發(fā)生是多因素共同作用的結(jié)果,其機(jī)制也比人們想象的復(fù)雜。在2011年,2組大規(guī)模的基因相關(guān)性分析(GWAS)研究表明,SLC14A1基因很可能與膀胱腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。SLC14A1基因?qū)儆谌苜|(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)家族,該基因全長為30kb,位于18號(hào)染色體18q12.1-18q21.1。SLC14A1基因編碼尿素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白B(UT-B)。該蛋白的主要功能,為在滲透梯度的作用下,輔助尿素的跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)。同時(shí),UT-B蛋白也是紅細(xì)胞上的一種血型抗原。目前,共有2種UT-B蛋白亞型,分別為UT-B1和UT-B2。UT-B1(389AA,約為43KDa)首先在人體骨髓紅系造血細(xì)胞中被克隆出,隨后被定位于全身多個(gè)組織器官。而UT-B2(445AA,約為43-54KDa)則在牛的腸道系統(tǒng)中率先被發(fā)現(xiàn),其在氨基端由于接入第3外顯子的開放閱讀框,相比于UT-B1具有額外的56個(gè)氨基酸。目前,僅在人腦的尾狀核內(nèi)發(fā)現(xiàn)了 UT-B2的mRNA,在近期的一項(xiàng)研究中,UT-B2 mRNA也被定位于膀胱組織。目前尚無發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)UT-B2蛋白的報(bào)道。相關(guān)的功能性研究表明,在腎臟組織內(nèi)的UT-B蛋白主要位于腎直血管降段的內(nèi)皮細(xì)胞上,該蛋白對(duì)于維持內(nèi)髓處的滲透梯度起到十分重要的作用。在腎外組織中,UT-B蛋白的功能,與防止尿素在細(xì)胞內(nèi)蓄積密切相關(guān)。在膀胱內(nèi)的尿液中,其尿素濃度為血液中尿素濃度的20-100倍。UT-B蛋白表達(dá)于尿路上皮的全層。在UT-B基因敲除小鼠中,其尿路上皮細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)出嚴(yán)重的凋亡及DNA損傷。在2014年,Li等研究發(fā)現(xiàn),UT-B蛋白在膀胱腫瘤中表達(dá)下降,而且其趨勢與腫瘤分級(jí)成負(fù)相關(guān)。綜上,UT-B蛋白在膀胱癌中的表達(dá)下降,很可能導(dǎo)致尿素在尿路上皮中蓄積,從而誘發(fā)癌變。目的:探究在膀胱腫瘤中導(dǎo)致SLC14A1基因及其編碼的UT-B蛋白異常表達(dá)的機(jī)制研究對(duì)象及方法:本研究共包含了 62例膀胱腫瘤樣本,以正常人體組織Western Blot蛋白膜、膀胱組織及其總cDNA和尿路上皮細(xì)胞系(NHU)作為對(duì)照。62例膀胱腫瘤樣本包括10例臨床TURBT標(biāo)本、2株膀胱腫瘤細(xì)胞(T24,5637)、3例膀胱癌總RNA、1例膀胱癌總cDNA及46例膀胱腫瘤和正常組織配對(duì)組織芯片標(biāo)本。首先在mRNA水平,我們通過RT-PCR技術(shù)來探究UT-B1 mRNA及UT-B2 mRNA在上述組織中的表達(dá)情況,用qPCR對(duì)上述樣本進(jìn)行了相對(duì)定量,并對(duì)所有PCR產(chǎn)物進(jìn)行Sanger法測序。同時(shí),在克隆出UT-B1、UT-B2及腫瘤中的UT-B蛋白轉(zhuǎn)錄本后,將其構(gòu)建入真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3中,用于后續(xù)的基因體外表達(dá)研究。在蛋白質(zhì)水平,采用Western Blot及免疫組化染色,來探究UT-B蛋白在正常膀胱組織與膀胱腫瘤組織中的差異性表達(dá)。在翻譯后修飾水平,我們首先將含目的基因的pcDNA3質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞中以作為對(duì)照。同時(shí),我們將上述目的基因克隆到pGH19質(zhì)粒中,采用蟾蜍卵細(xì)胞顯微注射技術(shù),對(duì)上述研究中的UT-B蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)功能進(jìn)行了研究。采用凝集素沉降實(shí)驗(yàn)及PNGase F酶消化實(shí)驗(yàn),來研究UT-B蛋白的糖基化修飾在膀胱腫瘤中的改變。采用細(xì)胞表面生物素化實(shí)驗(yàn),來分析不同轉(zhuǎn)錄本所編碼的UT-B蛋白,在細(xì)胞膜上的表達(dá)情況。結(jié)果:1.UT-B蛋白在正常膀胱組織中的表達(dá)。在mRNA水平,UT-B2 mRNA及UT-B1mRNA均表達(dá)于正常膀胱組織中。在蛋白質(zhì)水平,正常膀胱組織中的UT-B在Western Blot中表現(xiàn)為37-50KDa的較寬條帶。2.UT-B在膀胱腫瘤組織中的表達(dá)及序列分析。在mRNA水平,膀胱腫瘤中的UT-B轉(zhuǎn)錄本表達(dá)下降,其中UT-B2mRNA,表達(dá)率為 56.2%。UT-B1 表達(dá)率為 87.5%。在UT-B1mRNA中,有71.4%在第4外顯子開放閱讀框內(nèi)存在長度為24個(gè)堿基的序列缺失。此含有堿基缺失的UT-B1被命名為AUT-B1。在蛋白質(zhì)水平,膀胱腫瘤中的UT-B蛋白表達(dá)下降,在Western Blot中表現(xiàn)為在38KDa附近的單一條帶。免疫組化結(jié)果提示,UT-B蛋白在膀胱癌中的表達(dá)量和腫瘤的分級(jí)呈負(fù)相關(guān)。在46例組織中,UT-B在低級(jí)別腫瘤中的染色得分為1.61 ± 0.53(n=25),在高級(jí)別腫瘤中,其染色得分為0.52 ±0.43(n=21)。3.腫瘤特異性△UT-B1序列在細(xì)胞膜上的表達(dá)和功能情況。將含UT-B1、UT-B2及AUT-B1編碼序列的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HEK 293細(xì)胞后,對(duì)其細(xì)胞表面膜蛋白用生物素進(jìn)行標(biāo)記,Western結(jié)果顯示,△UT-B1相比于UT-B1更易在細(xì)胞膜表面聚集(4.31倍,n=4,p0.01)。蟾蜍卵細(xì)胞通水實(shí)驗(yàn)表明,△UT-B1的轉(zhuǎn)運(yùn)能力顯著低于UT-B2 及 UT-B1。4.膀胱腫瘤中UT-B蛋白表現(xiàn)為低唾液酸化。在本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中,應(yīng)用UT-B1、UT-B2及△UT-B1轉(zhuǎn)染的HEK 293細(xì)胞作為對(duì)照,主要研究對(duì)象為新鮮的TURBT組織。首先,脂筏分離試驗(yàn)表明,脂筏中糖基化的UT-B2蛋白表現(xiàn)為38-50KDa的較寬條帶,在去糖基化酶的作用下表現(xiàn)為38KDa的單一條帶。脂筏中糖基化的UT-B1表現(xiàn)為38KDa的條帶,去糖基化后呈現(xiàn)為28KDa�！鱑T-B1及膀胱腫瘤中的UT-B在脂筏中的表達(dá)形式及去糖基化形式與UT-B1相同。凝集素沉降實(shí)驗(yàn)表明,UT-B2,UT-B1和△UT-B1蛋白在293細(xì)胞中,其糖鏈結(jié)構(gòu)以N-乙酰葡萄糖胺及唾液酸為主,而膀胱腫瘤組織中所分離出的UT-B蛋白表現(xiàn)為低唾液酸化,與堿基缺失相互獨(dú)立。結(jié)論:首先在mRNA水平,UT-B 1及UT-B2 mRNA均表達(dá)于正常的膀胱組織中。在膀胱腫瘤組織中,UT-B2mRNA的表達(dá)率明顯下降(56.2%)。UT-B1 mRNA可以表達(dá)于大多數(shù)的膀胱腫瘤組織中(87.5%),而這其中有70%的UT-B1 mRNA含有長度為24個(gè)堿基的序列缺失。在蛋白質(zhì)水平,UT-B蛋白在正常膀胱組織中表現(xiàn)為38-50KDa連續(xù)致密條帶,而在膀胱癌中,UT-B蛋白則表現(xiàn)為位于38KDa附近的較窄條帶,且表達(dá)水平下降,其下降的程度與腫瘤的分級(jí)成負(fù)相關(guān)。在翻譯后修飾水平,含有堿基缺失的△UT-B1于HEK 293細(xì)胞中更易于在細(xì)胞表面聚集,但其生理功能顯著低于UT-B1及UT-B2。同時(shí),膀胱腫瘤中的UT-B蛋白表現(xiàn)為低唾液酸化,與堿基缺失互為獨(dú)立事件。綜上,我們發(fā)現(xiàn)UT-B蛋白在膀胱癌中的異常表達(dá),主要表現(xiàn)為UT-B1 mRNA堿基序列缺失及UT-B1蛋白低唾液酸化,此二者相互獨(dú)立。堿基缺失的UT-B1蛋白雖然有較強(qiáng)的上膜能力,但其功能較弱。這一結(jié)論,為SLC14A1基因及其產(chǎn)物UT-B蛋白成為膀胱腫瘤研究的靶點(diǎn)提供了新的科學(xué)依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R737.14

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