本文選題：滇重樓　切入點(diǎn)：鯊烯環(huán)氧酶　出處：《中草藥》2017年09期 　論文類型：期刊論文

【摘要】：目的克隆滇重樓Paris polyphylla var.yunnanensis三萜皂苷生物合成途徑中的關(guān)鍵酶鯊烯環(huán)氧酶(squalene epoxidase,SE)基因,并進(jìn)行原核表達(dá)。并用Real-time PCR法檢測cDNA樣本中SE1基因和SE2基因的相對量。方法以滇重樓根為材料提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板,根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的2組SE基因全長序列設(shè)計特異性引物,對SE基因進(jìn)行克隆后轉(zhuǎn)入到pEASY-T1 Simple Cloning Vector中,經(jīng)測序鑒定正確后,構(gòu)建pEASY-E1-SE表達(dá)載體,利用Art Media protein Expression/Amp+培養(yǎng)基自動誘導(dǎo)表達(dá)。Real-time PCR法檢測cDNA樣本中SE1和SE2基因的相對量。結(jié)果獲得了2條滇重樓SE基因,命名為ppSE1和ppSE2。ppSE1的全長為1 932 bp,開放閱讀框(ORF)為1 578 bp,編碼525個AA;ppSE2的全長為1 828 bp,ORF長為1 548 bp,編碼515個氨基酸。熒光定量PCR結(jié)果顯示ppSE1基因和ppSE2基因在莖和葉中的表達(dá)具有顯著差異,ppSE1的表達(dá)在葉中最為顯著。酶切和測序結(jié)果表明,原核表達(dá)載體pEASY-E1-SE構(gòu)建成功;SDS-PAGE分析顯示,在BL21(DE3)表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞中成功誘導(dǎo)表達(dá)了SE基因的2種融合蛋白。結(jié)論克隆了滇重樓的SE基因,獲得了在體外具有生物學(xué)活性的SE蛋白。ppSE1基因和ppSE2基因在滇重樓中具有不同的表達(dá)模式,在滇重樓次生代謝產(chǎn)物的合成中起著不同的作用。
[Abstract]:Objective to clone the key enzyme squalene epoxidaseSEE in the biosynthesis pathway of Paris polyphylla var.yunnanensis triterpenoid saponins. The relative amounts of SE1 gene and SE2 gene in cDNA samples were detected by Real-time PCR method. Methods Total RNA was extracted from root of Rhizoma Polygonum yunnanensis and reversed to cDNA. CDNA was used as template. According to the full length sequence of two sets of SE gene in transcriptional data, specific primers were designed and cloned into pEASY-T1 Simple Cloning Vector. After sequencing, the pEASY-E1-SE expression vector was constructed. The relative quantities of SE1 and SE2 genes in cDNA samples were detected by means of Art Media protein Expression/Amp medium. The results showed that two SE genes were obtained. The total length of ppSE1 and ppSE2.ppSE1 was 1 932 BP, the open reading frame was 1 578 BP, the length of ppSE1 and ppSE2 gene was 1 548 BP and 1 548 BP, respectively. The results of fluorescence quantitative PCR showed that ppSE1 gene and ppSE2 gene were in stem and leaf. The expression of PppSE1 was the most significant in the leaves. The results of restriction endonuclease digestion and sequencing showed that, SDS-PAGE analysis of prokaryotic expression vector pEASY-E1-SE showed that two kinds of fusion proteins of SE gene were successfully induced and expressed in BL21DE3 cells. Conclusion the SE gene of Rhizoma Dianopsis was cloned. Different expression patterns of SE protein, ppSE1 gene and ppSE2 gene were obtained in vitro and played different roles in the synthesis of secondary metabolites.
【作者單位】： 云南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院;
【基金】：國家自然科學(xué)基金資助項目(81160502) 云南省自然科學(xué)基金資助項目(2011FZ153) 云南省教育廳自然科學(xué)基金資助項目(2013J040);云南省教育廳自然科學(xué)基金資助項目(2014J063)
【分類號】：S567.239

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本文編號：1581276