本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因食品常用檢測(cè)方法的研究現(xiàn)狀與展望，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) , Journal of Anhui Agri Sci 2009, 37 ( 29) : 14066 - 14069 . .

責(zé)任編輯 　 夏靜 　 責(zé)任校對(duì) 　 況玲玲

轉(zhuǎn)基因食品常用檢測(cè)方法的研究現(xiàn)狀與展望
詹世紅
210095) 1, 2

,陳楚芹 ,李 聰 ,肖 笑

3

4

慶高要市恒興水產(chǎn)科技有限公司 , 廣東肇慶 526108; 3. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 ,江蘇南京 210095; 4. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 , 江蘇南京

摘要 　 介紹了轉(zhuǎn)基因食品的發(fā)展現(xiàn)狀 ,簡(jiǎn)述了常用的轉(zhuǎn)基因技術(shù) ,重點(diǎn)羅列了食品安全控制中轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)方法 ,并在此基礎(chǔ)上對(duì) 不同的檢測(cè)方法進(jìn)行了比較。 關(guān)鍵詞 　 轉(zhuǎn)基因食品 ; 基因重組 ; 現(xiàn)狀 ; 安全性 ; 展望 中圖分類(lèi)號(hào) 　Q789 　　 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 　A 　　 文章編號(hào) 　0517 - 6611 (2009) 29 - 14066 - 04
Sta tus and Prospect of Comm on D etecting M ethods of Tran sgen ic Food ZHAN Sh i2hong et a l 　 ( Institute of Food Science and Technology, Guangdong Ocean University, Zhanjiang, Guangdong 524025) Abstract 　The p resent development status of transgenic food was introduced. Common transgenic technologies were briefly reviewed. The de2 tection methods of different transgenic components in the food safety control were emphatically listed. On this basis, different detection methods were compared. Key words 　Transgenic food; Genetic recombination; Present status; Safety; Prospect
[1]

　　 轉(zhuǎn)基因技術(shù)是指利用生物技術(shù) ,將外源基因轉(zhuǎn)移到其他 物種中去 ,從而改造生物的遺傳特性 ,使其在性狀、 營(yíng)養(yǎng)品質(zhì) 等方面向人類(lèi)所需的目標(biāo)轉(zhuǎn)變。以轉(zhuǎn)基因生物為直接食品 或原料加工生產(chǎn)的食品就是轉(zhuǎn)基因食品。迄今為止轉(zhuǎn)基因 生物已經(jīng)被廣泛利用于食品領(lǐng)域 ,這主要是因?yàn)檗D(zhuǎn)基因技術(shù) 可以增加植物單位產(chǎn)出量 ,增強(qiáng)作物抗蟲(chóng)性和抗病性 ,提高 農(nóng)產(chǎn)品的耐貯性以及讓植物擺脫季節(jié)的影響。同時(shí) ,轉(zhuǎn)基因 技術(shù)也是培植植物新品種的主要方法。此外 , Powell等 從而降低土壤中有機(jī)物質(zhì)的流失。 發(fā) 現(xiàn) ,種植轉(zhuǎn)基因抗草甘膦作物會(huì)加強(qiáng)土壤中有機(jī)物質(zhì)的積聚 隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的廣泛應(yīng)用 ,它的安全性問(wèn)題也越來(lái)越

受到人們的重視。轉(zhuǎn)基因食品的潛在問(wèn)題包括 : 轉(zhuǎn)基因食物 的過(guò)敏性 ; 轉(zhuǎn)基因食品的毒性 ; 營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)改變問(wèn)題 ; 轉(zhuǎn)基因生 物的環(huán)境安全性以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)中存在的倫理道德問(wèn)題
[2]

該文從轉(zhuǎn)基因食品常用檢測(cè)方法研究現(xiàn)狀的角度出發(fā) ,探討 了這一領(lǐng)域的現(xiàn)狀與發(fā)展方向 ,以期為食品安全監(jiān)測(cè)中的轉(zhuǎn) 基因檢測(cè)方法的選擇提供依據(jù)。
1 　轉(zhuǎn)基因食品發(fā)展現(xiàn)狀

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的普及 ,轉(zhuǎn)基因食品已經(jīng)廣泛地滲透到

食物鏈中 ,國(guó)外市場(chǎng)中很大分額的加工食品如飲料、 啤酒和 早餐谷類(lèi)都含有轉(zhuǎn)基因生物成分。目前 ,世界上的轉(zhuǎn)基因食 品涵蓋了植物、 動(dòng)物源以及微生物源的多種食品。在轉(zhuǎn)基因 植物中 ,轉(zhuǎn)基因大豆、 玉米、 棉花和菜籽在商品化的轉(zhuǎn)基因作 棉花和其他轉(zhuǎn)基因作物播種面積已達(dá)到 8 100 萬(wàn) hm , 比
2003 年增長(zhǎng)了 20%
[3] 2

物中占到超過(guò) 99%的分額。 2004 年全球轉(zhuǎn)基因玉米、 大豆、 。在中國(guó) ,已有近 20 種轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)

43

, 吉宏武

13

,黃 明

型 ,主要指利用轉(zhuǎn)移或修飾相關(guān)基因 ,改變農(nóng)產(chǎn)品生長(zhǎng)分化、 肥料利用、 抗逆和抗蟲(chóng)害等性狀 ,從而達(dá)到增產(chǎn)的效果 ; ② 控 熟型 ,這種轉(zhuǎn)基因食品著重于食品的耐貯性 ,通過(guò)轉(zhuǎn)移或修 飾與控制成熟期有關(guān)的基因 ,從而使轉(zhuǎn)基因生物成熟期延遲 或提前 ; ③ 高營(yíng)養(yǎng)型 ,此類(lèi)食品以轉(zhuǎn)基因玉米、 土豆和菜豆為 代表 ,從改造種子貯藏蛋白質(zhì)基因入手 , 使其表達(dá)的蛋白質(zhì) 具有合理的氨基酸組成 ; ④ 保健型 ,主要是通過(guò)轉(zhuǎn)移病原體 抗原基因或毒素基因至糧食作物或其他農(nóng)作物中 ,為食用者 提供預(yù)防疾病的物質(zhì)。如 : 魏振林等
[4]

基因大豆油中 22 種元素含量 ,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因大豆油中的 Zn、 Cr 和 Fe等一些能幫助人體預(yù)防疾病的元素含量比較高 ; ⑤ 加 工型 ,是以轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物作原料 ,進(jìn)行再加工而得到的食品 轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物比原物便于加工。
[5]

。

發(fā)展程度也不一樣。轉(zhuǎn)基因植物的發(fā)展水平最高的主要是 應(yīng)用于生產(chǎn)糖類(lèi)以及工業(yè)用酶和脂肪上的植物。此外 ,利用 轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)食用疫苗是當(dāng)前食品生物技術(shù)研究的熱點(diǎn) 之一。 2002 年 , 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所已通過(guò)重 組 DNA 技術(shù)選育出具有抗肝炎功能的西紅柿。在動(dòng)物方 面 ,轉(zhuǎn)基因技術(shù)在魚(yú)類(lèi)和畜產(chǎn)品中的應(yīng)用已經(jīng)有了一定的成 果。近年來(lái) ,在魚(yú)類(lèi)產(chǎn)品中 ,激素基因和抗凍蛋白基因的轉(zhuǎn) 移、 珠蛋白基因的轉(zhuǎn)移以及用精子載體法轉(zhuǎn)基因技術(shù)、 光敏 生物素標(biāo)記探針檢測(cè)以及 PCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)基因魚(yú)技術(shù)等方面都 取得了較大進(jìn)展。而在畜產(chǎn)品中 ,中國(guó)已經(jīng)成功的通過(guò)轉(zhuǎn)基 因技術(shù)使羊乳汁中含有人類(lèi)的凝血因子 , 同時(shí)具有食用和 藥用價(jià)值。轉(zhuǎn)基因微生物相對(duì)應(yīng)用涉及面也較廣 ,比較典型 的是在發(fā)酵食品工業(yè)和食品添加劑工業(yè)的應(yīng)用
2　 常用的轉(zhuǎn)基因技術(shù)方法
[6]

33

　( 1. 廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院 ,廣東湛江 524025; 2. 廣東省肇

由于產(chǎn)品對(duì)象的不同 ,轉(zhuǎn)基因技術(shù)在食品工業(yè)應(yīng)用中的

入了田間試驗(yàn)或環(huán)境釋放階段 , 6 種轉(zhuǎn)基因植物被批準(zhǔn)進(jìn)行 商業(yè)化生產(chǎn)。 按照功能 ,轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品可以大致分為以下幾類(lèi) : ① 增產(chǎn)

轉(zhuǎn)基因技術(shù)通常包括 5 個(gè)步驟 : ① 取得符合要求的 DNA

基金項(xiàng)目 　轉(zhuǎn) 基 因 生 物 新 品 種 培 育 重 大 專(zhuān) 項(xiàng) 課 題 ( 2009ZX08012 2 014B ) 。 作者簡(jiǎn)介 　 詹世紅 ( 1969 - ) ,男 ,湖南常德人 ,工程師 ,從事食品加工與 安全領(lǐng)域的工作 。 3 通訊作者 。 收稿日期 　2009 2 2 06 08

片段 ,即“ 目的基因 ” ② ; 利用質(zhì)�；虿《� DNA 作為目的基因 載體 ,將目的基因與之連接成重組 DNA; ③ 把重組 DNA 引入 某種細(xì)胞 ; ④ 利用載體的某種顯示機(jī)制把目的基因能表達(dá)的 受體細(xì)胞挑選出來(lái) ; ⑤ 表達(dá) , 采用合適的條件 , 得到高表達(dá) 的產(chǎn)物
[7]

。

應(yīng)用 ICP2 檢測(cè)轉(zhuǎn) MS
,

。

37 卷 29 期 　　　　　　　　　　　　　　　　 詹世紅等 　 轉(zhuǎn)基因食品常用檢測(cè)方法的研究現(xiàn)狀與展望

14067

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物食品的生產(chǎn)中 ,主要應(yīng)用的是可遺傳和非可 遺傳構(gòu)件。前者主要有 3 種方式 : 原核顯微注射、 體細(xì)胞核 移植和精子載體法。利用這種方法所得到的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可 以在生產(chǎn)性能如生長(zhǎng)速度、 營(yíng)養(yǎng)利用率、 奶和毛的產(chǎn)量以及 疾病抵抗能力上都得到提高和改進(jìn)。而含有非可遺傳構(gòu)件 的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物則是把重組核酸片段直接引入動(dòng)物體細(xì)胞。 外源 DNA 的導(dǎo)入包括 : 顯微注射法、 電穿孔技術(shù)、 基因槍和 脂質(zhì)體法等。目前認(rèn)為轉(zhuǎn)基因疫苗也含概在非可遺傳構(gòu)件 的范圍中 ,可以誘導(dǎo)特定的抗原細(xì)胞免疫應(yīng)答或體液來(lái)誘導(dǎo) 免疫反應(yīng)
[8]

的 ,迄今為止 ,已經(jīng)有大約 20 種蛋白質(zhì)檢測(cè)方法在轉(zhuǎn)基因檢 測(cè)領(lǐng)域中投入了使用。
3. 1 　 核酸水平 　當(dāng)外源基因插入到靶向受體中時(shí) ,一般要

構(gòu)建啟動(dòng)子、 終止子、 選擇標(biāo)記基因和報(bào)告基因等。核酸水 平檢測(cè)轉(zhuǎn)基因食品主要是指檢測(cè)遺傳物質(zhì)中是否含有插入 的外源基因 ,包括基因片斷的整合位點(diǎn)、 多態(tài)性、 含量分析以 及啟動(dòng)子、 終止子、 選擇標(biāo)記基因和報(bào)告基因的核酸序列。 核酸水平檢測(cè)轉(zhuǎn)基因食物主要應(yīng)用到的方法有 PCR 法和基 因芯片技術(shù)。除此之外 ,分子生物學(xué)也利用 Southern 雜交技 術(shù)檢測(cè) DNA 的特定序列。與 Southern 雜交技術(shù)相對(duì)應(yīng) ,
Northern印跡雜交主要用于測(cè)定特定外源基因 DNA 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)

。

在植物方面 ,常用的轉(zhuǎn)基因方法主要有農(nóng)桿菌導(dǎo)入法、 基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法和花粉管通道法。在水稻育種中 ,利用完 整的 C4 植物玉米 pepc 基因與用作選擇標(biāo)記的潮霉素磷酸 轉(zhuǎn)移酶基因 ( HPT )構(gòu)成表達(dá)載體 ,采用農(nóng)桿菌導(dǎo)入 ,可以提 Ⅱ 高水稻等 C3 作物的光合效率。在蔬菜轉(zhuǎn)基因方面 ,導(dǎo)入可 以調(diào)控或表達(dá)特定酶產(chǎn)物的基因 ,以達(dá)到增加蔬菜抗性和產(chǎn) 量的作用。例如 ,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將含有豇豆胰蛋白酶抑 制劑基因 ( CpTI)和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因 (NP I ) 的重組質(zhì) Ⅱ 粒導(dǎo)入普通不結(jié)球白菜中 ,從而獲得具有卡那霉素抗性的再 生植株。此外 ,轉(zhuǎn)基因大豆和轉(zhuǎn)基因棉花都是世界關(guān)注的焦 點(diǎn)問(wèn)題 ,中國(guó)大豆工程技術(shù)研究中心用基因工程技術(shù)將外源
DNA 導(dǎo)入大豆 , 培育出高抗大豆花葉病毒、 農(nóng)藝性狀優(yōu)良以

物 mRNA 分子的大小和豐度。
3. 1. 1 　 PCR 法。 因?yàn)榫哂泻芨叩撵`敏度 , PCR 方法在轉(zhuǎn)基

因領(lǐng)域使用最為廣泛 (表 1 ) 。與蛋白質(zhì)具有組織特異性相 比 , PCR 技術(shù)不受到材料的限制。另外核酸的性質(zhì)比蛋白質(zhì) 穩(wěn)定 ,變性之后復(fù)性也更為容易。在現(xiàn)今食品安全檢測(cè)領(lǐng) 域 , PCR 技術(shù)最廣泛的應(yīng)用是在檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆和轉(zhuǎn)基因 玉米。 由于 PCR 技術(shù)的高靈敏性 , 非靶片段的污染問(wèn)題非常 嚴(yán)重 ,另外 PCR 體系中的 DNA 聚合酶沒(méi)有 3 ’5 ’ 2 內(nèi)切功能 , 很高的要求。一般來(lái)說(shuō) ,引物的選擇比較關(guān)鍵 , PCR 技術(shù)中 , 引物一般為 15 ～25 nt, 引物與模板的配對(duì)率需要在 70%以 上。另外 ,上下引物的配對(duì)率要小于 5 bp, 引物自身配對(duì)率 需要小于 3 bp。 與傳統(tǒng) PCR 相比 ,多重 PCR 技術(shù)利用一對(duì)以上的引物 ,
[ 14 ]

所以錯(cuò)配的可能性較大。為了解決這些問(wèn)題 , 在利用 PCR 技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因食物時(shí) ,對(duì)于操作條件和體系原料選擇都有

及產(chǎn)量高的大豆品種。而在棉花方面 , 自從單價(jià) B t抗蟲(chóng)棉 品種和雙價(jià) (含 B t基因和 CpTI基因 ) 抗蟲(chóng)棉品種被培育出 后 ,現(xiàn)在抗棉蚜蟲(chóng)、 抗棉花枯萎病和黃萎病、 蘿卜抗真菌蛋白 的基因 ( R 2af2P I)β2 3 2 萄糖酶基因等的轉(zhuǎn)基因研究也正 1, 葡 在進(jìn)行
[9]

。當(dāng)然 ,轉(zhuǎn)基因技術(shù)除了在農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)中直接使用

以外 , 植物可食性疫苗轉(zhuǎn)基因也是轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域的重要 組成。 目前 ,一些新的轉(zhuǎn)基因技術(shù)除了使轉(zhuǎn)基因食品具備一般 發(fā)明了一種簡(jiǎn)單可控的轉(zhuǎn)基因技術(shù) , 使在轉(zhuǎn)基因操作

可以同時(shí)擴(kuò)增多種序列 ,從而對(duì)幾個(gè)靶序列進(jìn)行檢測(cè) ,可以 節(jié)省檢測(cè)的時(shí)間 , 降低產(chǎn)物污染的可能。張平平等 以大 豆外源凝集素基因和肌動(dòng)蛋白基因作為內(nèi)部對(duì)照 ,運(yùn)用多重
PCR 技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆 ,結(jié)果表明當(dāng)轉(zhuǎn)基因大豆含量?jī)H為 0. 15%時(shí) ,仍然可以對(duì)轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行可靠鑒定 , 檢測(cè)靈敏

的優(yōu)點(diǎn) , 還可以被后續(xù)的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)提供便利。沈志成 等
[ 10 ]

時(shí)附加一個(gè)讓轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)除草劑苯達(dá)松失去抗性的步驟。 這樣在種植時(shí) , 可以利用苯達(dá)松分離轉(zhuǎn)基因水稻和常規(guī)水 稻。因此 ,這個(gè)技術(shù)可以用于隔離轉(zhuǎn)基因作物 ,使它們?cè)诳?制條件下生長(zhǎng) , 從另一個(gè)層面實(shí)現(xiàn)了對(duì)轉(zhuǎn)基因食物的安全 控制。
3 　常用的檢測(cè)方法

度較傳統(tǒng) PCR 方法提高了很多。此外 ,多重 PCR 結(jié)合毛細(xì) 管凝膠電泳和激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)激素可以同時(shí)檢測(cè) 5 種轉(zhuǎn) 基因玉米。 針對(duì)傳統(tǒng) PCR 可能出現(xiàn)的假陰性問(wèn)題 , 巢式 PCR ( nes2
[ 15 ]

PCR 是利用兩套 PCR 引物對(duì)巢式引物進(jìn)行兩輪 PCR 擴(kuò)增反

轉(zhuǎn)基因技術(shù)的安全性問(wèn)題受到國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注。

應(yīng)。第一輪擴(kuò)增外引物的擴(kuò)增產(chǎn)物被作為第 2 輪擴(kuò)增的模 板 ,在內(nèi)引物的存在下進(jìn)行擴(kuò)增。這種方法是一種很有效的 水產(chǎn)飼料和食品的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法。陶冉等 的研究中采 用巢式 PCR 利用 F1R1 2F2R2 和 F2R2 2F3R3 引物對(duì) ,檢測(cè)了
32 種不同品牌的國(guó)產(chǎn)水產(chǎn)飼料 ,轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性率為 90. 6% ,而

1990 年 , FAO 和 WHO 建立了有關(guān)生物技術(shù)食品安全的評(píng)估
[ 11 ]

體系。 1998 年國(guó)際生物技術(shù)研究所等機(jī)構(gòu)對(duì)于轉(zhuǎn)基因食物 致敏性提出了“ 樹(shù)型判定法 ” 的評(píng)估策略 。美國(guó)政府為了 防止轉(zhuǎn)基因玉米中的毒素提高害蟲(chóng)抗藥性 ,規(guī)定美國(guó)玉米產(chǎn) 區(qū)農(nóng)場(chǎng)至少需要種植 20%以上的非轉(zhuǎn)基因玉米。此外 ,世界 上大多數(shù)國(guó)家和國(guó)際組織還專(zhuān)門(mén)對(duì)轉(zhuǎn)基因食品實(shí)施了標(biāo)識(shí) 管理。歐盟的標(biāo)識(shí)管理?xiàng)l例利用“ 極限管理 ” 方法 ,規(guī)定如果 食品材料中有超過(guò) 1%的轉(zhuǎn)基因成分 ,則需要標(biāo)識(shí)
[ 12 ]

且兩種引物對(duì)的陽(yáng)性符合率為 100% 。半巢式 PCR 則利用 一對(duì)半引物 ,其中一個(gè)被用于 2 次 PCR 反應(yīng)中�？傊� ,巢式
PCR 和半巢式 PCR 都可以解決由于食品深加工對(duì) DNA 分

。

子造成的嚴(yán)重破壞從而造成樣品難以檢測(cè)的問(wèn)題。

一般來(lái)說(shuō) ,轉(zhuǎn)基因檢測(cè)分為兩類(lèi) ,一種是核酸水平上的 ,
[ 13 ]

目前的轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)中有超過(guò) 400 對(duì) PCR 檢測(cè)引 物和以及 43 種內(nèi)源參照基因 。另一類(lèi)是蛋白質(zhì)水平上

定量熒光 PCR 法 ( RTQ 2PCR )以及反轉(zhuǎn)錄 RT2PCR 法。 RTQ 2
PCR 可以篩選轉(zhuǎn)基因特異 DNA 片段 ,已經(jīng)被一些國(guó)家作為

ted PCR ) 和半巢式 PCR ( sem i2nested PCR ) 應(yīng)運(yùn)而生。巢式

此外 ,常用的 PCR 法還有定量競(jìng)爭(zhēng)性 QC 2PCR 法 ,實(shí)時(shí)

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　　　　　　　　　　 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2009 年

控制食品安全的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。 RTQ 2PCR 常選擇標(biāo)記基 因 ,再檢測(cè)特定轉(zhuǎn)化的靶基因。實(shí)時(shí)熒光 PCR 利用雜交探 針和熒光檢測(cè) ,可以提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏性。由于這個(gè) 技術(shù)是采用封閉的檢測(cè)模式 , PCR 產(chǎn)物不需要后期處理 ,有 效的解決 PCR 后污染問(wèn)題。蔡慧農(nóng)等
[ 16 ]

本比較高。即使如此 , 這種微型化 , 自動(dòng)化的技術(shù)有著非常 大的發(fā)展前景 ,必會(huì)被越來(lái)越廣泛的利用
[ 20 ]

。

由不同的 PCR 技術(shù)結(jié)合分子雜交等技術(shù)也可以改進(jìn)傳 統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)里面可能存在的問(wèn)題。例如 , PCR 技術(shù)還可以和 電化學(xué)發(fā)光技術(shù)、 技術(shù)以及雙探針雜交技術(shù)結(jié)合起來(lái)形 PCR 成電化學(xué)發(fā)光 PCR 法。周穎等
[ 21 ]

選擇了內(nèi)源基因大

豆植物凝集素 ( lectin ) 、 玉米轉(zhuǎn)化酶 ( invertase ) 和外源基因 抗草甘膦除草劑的 5 2 醇式丙酮酰莽草酸 2 2 酸合成酶 烯 3磷
( cp4ep sp s) 、 抗歐洲玉米螟的蘇云金芽孢桿菌殺蟲(chóng)毒蛋白 ( cryI b) 的 TaqMan 探針 ,建立了轉(zhuǎn)基因大豆和轉(zhuǎn)基因玉米 A

把三重 PCR 反應(yīng) ,毛細(xì)管

電泳以及激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)結(jié)合在一起 ,代替了瓊脂糖凝膠 電泳作為多重 PCR 的檢測(cè)方法 ,把檢出限降低到 0. 05% ,是 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)檢出限的十分之一。此外 , 周萍萍 等
[ 22 ]

的 TaqMan2 光定量 PCR 檢測(cè)方法 , 初步實(shí)現(xiàn)可轉(zhuǎn)基因食品 熒
PCR 定量分析和品種鑒定。當(dāng)然 , 實(shí)時(shí)熒光 PCR 也存在其

對(duì)于轉(zhuǎn)基因大豆建立了低密度基因芯片的檢測(cè)體系。

此外 ,利用多重 PCR 對(duì)樣品核酸進(jìn)行擴(kuò)增和熒光標(biāo)記 ,產(chǎn)物 再與基因芯片雜交。這種方法避免電泳檢測(cè) PCR 的擴(kuò)增產(chǎn) 物 ,實(shí)現(xiàn)了多個(gè)基因的同時(shí)檢測(cè) ; 更重要的是 ,把這兩種技術(shù) 結(jié)合可以把檢測(cè)和鑒定的過(guò)程合二為一。
3. 2 　 蛋白質(zhì)水平 　 常用的方法有酶聯(lián)免疫檢測(cè)法 ( EL ISA ) 、

他問(wèn)題 ,它需要特殊的熱循環(huán)儀器 ,成本比普通 PCR 要高出 很多。同時(shí) , PCR 體系中任何一項(xiàng)或者幾項(xiàng)濃度的偏差都可 能導(dǎo)致假陽(yáng)性的結(jié)果。所以 , 現(xiàn)今的 RTQ 2PCR 技術(shù)也在各 個(gè)方面不斷改進(jìn) : 在擴(kuò)增前加入 DNA 降解酶以清除擴(kuò)增前 體系中的 PCR 產(chǎn)物 ;利用高保真酶如高質(zhì)量重組熱啟動(dòng) Taq 性 ; 羅氏應(yīng)用科學(xué)部門(mén)推出了 UPL 通用探針庫(kù) ( universal p ro2 可以識(shí)別單個(gè)堿基的錯(cuò)配 ,不但實(shí)現(xiàn)一個(gè)探針對(duì)多個(gè)基因的 檢測(cè) ,而且提高了反應(yīng)的靈敏性和特異性
[ 17 ]

“ 側(cè)流 ” 型免疫測(cè)定 ( lateral flow )和 W estern 印跡法。這幾種 免疫學(xué)方法都是利用抗原抗體的高度特異性。 EL ISA 成本 較低 ,在食品安全檢測(cè)中被廣泛應(yīng)用 ,而“ 側(cè)流 ” 型免疫測(cè)定 操作簡(jiǎn)單也是轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的常用技術(shù) 。此外 , 包括色譜 技術(shù)、 近紅外波譜技術(shù) ( N IR ) 等相關(guān)檢測(cè)方法也已經(jīng)建立。 但是 ,這一類(lèi)方法對(duì)樣品處理步驟要求較高 ,它需要蛋白質(zhì) 保持一個(gè)完整無(wú)缺的 3 級(jí)或 4 級(jí)結(jié)構(gòu) ,這樣在免疫檢測(cè)或一 維或二維凝膠電泳蛋白結(jié)構(gòu)比對(duì)時(shí)才能保證結(jié)果的準(zhǔn)確 性
[ 12 ] [ 23 ]

定量 引物 產(chǎn)物污染 特點(diǎn) 應(yīng)用

參考文獻(xiàn)

轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)中 ,基因芯片技術(shù)可以將一般通用的報(bào)告 基因、 抗性基因、 啟動(dòng)子和終止子的特異片段制成檢測(cè)芯片 與待測(cè)樣品雜交 ,從而判定樣品中的轉(zhuǎn)基因成分
[ 18 ]

在大豆、 玉米和棉花等農(nóng)產(chǎn)品的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中廣泛應(yīng)用。另 外 ,基因芯片技術(shù)還可以篩選突變或抗性等轉(zhuǎn)基因所需要的 目的基因
[ 19 ]

因成分 ,而食品中轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)通常比較復(fù)雜 ,所以利 用普通 PCR 技術(shù)往往不能獲得完整的信息 , 特別是大量的 測(cè)因?yàn)橐淮慰梢远ㄐ院Y選大量不同種類(lèi)的基因修飾物。但 是 ,這個(gè)方法也存在一些不足 ,即每種檢測(cè)樣品必須有與之 相配的非轉(zhuǎn)基因作物的芯片 ,而且芯片檢測(cè)的操作復(fù)雜 ,成

不同品系轉(zhuǎn)基因食物檢測(cè)的需要時(shí)。相比這下 , DNA 芯片檢

DNA 聚合酶和 Easy2 高保真聚合酶等以減少錯(cuò)配的可能 A

belibrary) ,采用 LNA ( locked nucleic acid ) 技術(shù)合成探針。

。

表 1 　不同 PCR法在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中的比較

3. 1. 2 　基因芯片。 基因芯片又稱(chēng)為 DNA 微探針陣列。在

Table 1 　Com par ison of d ifferen t PCR m ethods in the tran sgen ic detec2 tion

。

否

是 一對(duì)以上 高 低 可能出現(xiàn)假 節(jié)省檢測(cè)時(shí)間 陰性和假 陽(yáng)性 定性檢測(cè)轉(zhuǎn) 定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基 基因作物 因作物

與普通 PCR 技術(shù)比較 , PCR 技術(shù)一次只能對(duì)一種轉(zhuǎn)基

PCR 法 Conven2 tional PCR

常規(guī)

PCR 法 Multip lex PCR

多重

fluorescence PCR

是

低 污染 低 , 靈 敏 避 免 假 性高 陰性 定量檢測(cè)各種 原材 料、 合 混 物和加工食品 的轉(zhuǎn)基因成分
[ 17 ]

[ 14 ]

。

實(shí)時(shí)定量 巢式 PCR, 熒光 PCR 法 半巢式 PCR 法 Real2tim e Nested PCR, quantitative Sem i2nested
PCR

3. 2. 1 　 EL ISA 法。 酶連免疫吸附技術(shù)實(shí)驗(yàn)的原理是利用抗

原和抗體的特異性免疫 ,將其中的一種包被之后 ,再將酶標(biāo) 抗體結(jié)合到載體上 ,利用酶和底物的顯色反映定量測(cè)定抗原 量或抗體量。在轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)中 , EL ISA 一般作為定性 檢測(cè)的方法 ,但是在某些條件下也可以用于半定量測(cè)試。利 用 EL ISA 法可以成功檢測(cè)出傳統(tǒng)加工產(chǎn)品中混有的 2% 是利用抗原抗體的特異性反應(yīng) ,它操作簡(jiǎn)便 ,適用于現(xiàn)場(chǎng)檢 測(cè)和初篩。但是利用抗原抗體反應(yīng)存在一些問(wèn)題 , 例如 , 首 先不能避免的就是抗原抗體反應(yīng)的專(zhuān)一性。其次 ,很多檢測(cè) 食品是加工產(chǎn)品 ,其中的蛋白質(zhì)的抗原性很容易被破壞。
表 2 　 PCR法和 EL ISA 法在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中的比較
tran sgen ic detection Table 2 　Com par ison between PCR m ethod and EL ISA m ethod in the

是 兩套

定量 檢測(cè) 轉(zhuǎn)基 因水 產(chǎn)食 品以 及轉(zhuǎn) 基因 加工食品
[ 15 ]

檢測(cè)方法

,并已經(jīng)

Detection methods

檢測(cè)對(duì)象 檢測(cè)工具 樣品干擾度 靈敏度 檢測(cè)品目多樣性 大量篩選 定量 限制

發(fā)應(yīng)用在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域。此項(xiàng)技術(shù)的原理與基因芯片

Round Ready大豆中 CP4 2EPSP 蛋白質(zhì)
PCR 法 PCR method DNA

[ 24 ]

。此外 , 試紙法也

EL ISA 法 EL ISA method

寡核苷酸引物 較高 0. 01% ～0. 10% 適合 適合 適合 高度加工

蛋白質(zhì) 抗體 較低 0. 5% ～1% 不適合 適合 適合 蛋白質(zhì)變性

　 : 數(shù)據(jù)來(lái)自參考文獻(xiàn) [ 25 ]。 注

　Note: The data are from reference [ 25 ].

3. 2. 2 　蛋白質(zhì)芯片。 與基因芯片對(duì)應(yīng) , 蛋白質(zhì)芯片也被開(kāi)

37 卷 29 期 　　　　　　　　　　　　　　　　 詹世紅等 　 轉(zhuǎn)基因食品常用檢測(cè)方法的研究現(xiàn)狀與展望

14069

相似 ,它可以高通量地測(cè)定蛋白質(zhì)大小分子間的互相作用和 生物活性 ,也可以準(zhǔn)確定性和定量檢測(cè)目的蛋白質(zhì)
[ 26 ]

。轉(zhuǎn)

基因食品中 ,外源基因的最終表達(dá)產(chǎn)物和作用物是蛋白質(zhì) , 通過(guò)不同的探針陣列測(cè)定外源基因的表達(dá)產(chǎn)物 ,可以作為基 因芯片檢測(cè)的補(bǔ)充 ,彌補(bǔ)基因芯片檢測(cè)的不足。但是蛋白質(zhì) 芯片依然存在一些難以規(guī)避的問(wèn)題 , 例如蛋白質(zhì)的穩(wěn)定問(wèn) 題 ,這就需要芯片載體材料使活性蛋白特異有序的固定。此 外 ,芯片的敏感度和成像等問(wèn)題也是未來(lái)蛋白芯片發(fā)展的重 點(diǎn)
[ 27 ]

。

3. 2. 3 　蛋白質(zhì)組分析技術(shù)。 蛋白質(zhì)組差異分析技術(shù)可以用

來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物中外源基因非預(yù)期效應(yīng)。首先在蛋白質(zhì) 組水平上找出轉(zhuǎn)基因植物和非轉(zhuǎn)基因植物的差異 ,再利用質(zhì) 譜分析等技術(shù)對(duì)差異蛋白進(jìn)行分析。另外 ,轉(zhuǎn)基因植物外源 基因的非預(yù)期效應(yīng)的安全性評(píng)價(jià)也是轉(zhuǎn)基因食品安全監(jiān)控 的很重要的一部分
[ 20 ]

。常規(guī)的化學(xué)方法只能檢測(cè)化學(xué)成分

的變化 ,卻難以準(zhǔn)確反映外源基因產(chǎn)生的非預(yù)期效應(yīng)。一般 來(lái)說(shuō) ,轉(zhuǎn)基因植物外源基因的非預(yù)期效應(yīng)的監(jiān)控是利用蛋白 質(zhì)組差異分析技術(shù)和基因芯片技術(shù) ,因?yàn)檫@兩種技術(shù)都可以 有效地比較轉(zhuǎn)基因植物食品和非轉(zhuǎn)基因親本植物之間的 差異。
4 　展望

轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展方向除了在傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)上 改進(jìn)和幾種檢測(cè)技術(shù)的組合以外 ,還包括有以往沒(méi)有用于轉(zhuǎn) 基因食物領(lǐng)域的檢測(cè)方法在這個(gè)領(lǐng)域的嘗試以及全新的技 術(shù)。例如 ,色譜技術(shù)、 毛細(xì)管電泳技術(shù)、 近紅外波譜技術(shù)和超 分支滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)等 分。Hurburgh等 問(wèn)題。 此外 ,免疫 PCR 被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域 ,它也可以 被應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)領(lǐng)域。傳統(tǒng) PCR 檢測(cè)方法是利用 瓊脂糖凝膠電泳分析產(chǎn)物 , 結(jié)果可能出現(xiàn)假陽(yáng)性 ; 而免疫
PCR 結(jié)合了 PCR 的高效性與 EL ISA 的高特異性。該技術(shù)首
[ 29 ] [ 28 ]

。食品加工過(guò)程可能破壞植物纖維

結(jié)構(gòu) ,以致轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法難以判斷食品是否含有轉(zhuǎn)基因成 利用近紅外波譜技術(shù)初步解決了這個(gè)

先利用 PCR 對(duì)目標(biāo)核酸進(jìn)行擴(kuò)增 ,再用標(biāo)記探針與之雜交 , 最后用堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈親和素進(jìn)行 EL ISA 檢測(cè) ,使檢測(cè) 的靈敏度和準(zhǔn)確度都有很大的提高 ,因此預(yù)計(jì)這種技術(shù)在轉(zhuǎn) 基因食品檢測(cè)領(lǐng)域也將具有很大的發(fā)展前景。 參考文獻(xiàn)
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(上接第 14008 頁(yè) )

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  本文關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因食品常用檢測(cè)方法的研究現(xiàn)狀與展望，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。