本文關(guān)鍵詞： SPATA2 支持細(xì)胞 精子發(fā)生 抑制素 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)　出處：《中國農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：支持細(xì)胞是睪丸曲細(xì)精管中的一種體細(xì)胞,它的主要功能是為精子發(fā)生提供了一個穩(wěn)定的環(huán)境,支持生殖細(xì)胞的增殖與分化。支持細(xì)胞之間緊密聯(lián)結(jié),形成血睪屏障,其分泌的各種細(xì)胞因子也對精子發(fā)生產(chǎn)生重要影響。已有研究表明,精子發(fā)生相關(guān)蛋白2 (spermatogenesis-associated protein 2,SPATA2)高表達(dá)于大鼠及人的睪丸支持細(xì)胞,但是這一蛋白在雄性個體的生殖系統(tǒng)中所發(fā)揮的功能仍然不明確。本論文證明了 SPATA2在小鼠的睪丸支持細(xì)胞中高表達(dá),并且通過CRISPR/Cas9技術(shù)建立了 SPATA2基因敲除小鼠模型,之后進(jìn)一步研究了敲除動物在雄性生殖力上相對于野生型的差異,以及其發(fā)揮作用的機(jī)制。主要取得了以下研究結(jié)果:1. Real-time PCR和Western blot定量方法證明,SPATA2在成年小鼠睪丸中的表達(dá)量高于其他組織器官和青春發(fā)育期的睪丸。免疫組織化學(xué)方法證明,SPATA2蛋白定位于睪丸曲細(xì)精管中的支持細(xì)胞胞質(zhì)。2.利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù),采用Cas9的突變體Cas9n核酸酶對SPATA2基因進(jìn)行定點突變,產(chǎn)生F0代突變個體,經(jīng)過分析篩選出最優(yōu)突變進(jìn)行建系。雜交兩代后得到純合個體,通過RT-PCR、Western blot和免疫熒光驗證了睪丸中基因敲除的效率,用于進(jìn)一步的研究。3.分析了雄性SPATA2敲除小鼠生殖功能的各項指標(biāo),發(fā)現(xiàn)敲除小鼠的睪丸縮小、重量較同窩的野生型對照降低了三分之一,4月齡的小鼠睪丸出現(xiàn)曲細(xì)精管直徑較小、生精上皮變薄的現(xiàn)象。進(jìn)一步分析后發(fā)現(xiàn),敲除小鼠附睪尾中精子數(shù)量下降了 40%。并且精子中出現(xiàn)了一些形態(tài)異常的狀況,精子活力也有所降低。4.配種實驗發(fā)現(xiàn),和同窩的對照相比,SPATA2敲除雄鼠的窩產(chǎn)仔數(shù)平均降低了 2.36只,差異顯著。接下來又利用體內(nèi)受精實驗,證明了與敲除雄鼠交配的超數(shù)排卵雌鼠,其卵母細(xì)胞受精率表現(xiàn)出明顯下降。5.免疫組織熒光染色證明,敲除SPATA2的小鼠睪丸中,PCNA的陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少,而凋亡的細(xì)胞沒有增加。進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn),PLZF標(biāo)記的精原干細(xì)胞的數(shù)量也有所降低,但差異不顯著;SCP3與γH2A.X所標(biāo)記的精母細(xì)胞的數(shù)量均有顯著的下降。這初步解釋了 SPATA2敲除小鼠精子數(shù)量減少的直接原因。6.鑒于SPATA2表達(dá)于支持細(xì)胞,用Wt1標(biāo)記支持細(xì)胞的方法檢測了睪丸發(fā)育時期及成年后支持細(xì)胞的數(shù)量,得到的結(jié)論是支持細(xì)胞的數(shù)量沒有變化。之后運(yùn)用生物素示蹤法檢測血睪屏障的完整性,發(fā)現(xiàn)SPATA2敲除小鼠的血睪屏障受損,這進(jìn)一步揭示了睪丸中生殖細(xì)胞增殖減弱、數(shù)量減少的原因。7.對睪丸支持細(xì)胞表達(dá)的基因進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)抑制素α亞基在敲除小鼠睪丸中表達(dá)升高,提示這可能是產(chǎn)生一系列表型的根本原因。同時,檢測到了垂體中卵泡刺激素FSHβ亞基表達(dá)的降低。綜上所述,本論文在小鼠中證明了,SPATA2表達(dá)于睪丸的支持細(xì)胞胞質(zhì),并且運(yùn)用CRISPR技術(shù)建立了 SPATA2敲除小鼠模型,揭示了 SPATA2的敲除會導(dǎo)致睪丸中FSH的負(fù)控因子——抑制素的表達(dá)上升,從而使得FSHβ表達(dá)降低,雄性生殖系統(tǒng)受損,精子數(shù)量減少,生殖能力減弱。
[Abstract]:Support is a kind of somatic cells in seminiferous tube, its main function is to provide a stable environment for spermatogenesis, proliferation and differentiation of germ cells. Support between Sertoli cells are closely connected to form the blood testis barrier, the secretion of various cytokines also have an important effect on spermatogenesis. Studies have shown that spermatogenesis related protein 2 (spermatogenesis-associated protein 2, SPATA2) high expression in rat and human Sertoli cells, but play this protein in the male reproductive system of the individual function is still not clear. This paper proves that SPATA2 in mouse Sertoli cells and the high expression. CRISPR/Cas9 established the SPATA2 gene knockout mouse model, after further study of the knockout animal compared to wild type differences in male reproductive capacity, as well as the role of machine System. The main results are as following: Real-time PCR and Western blot proved that the 1. quantitative methods, the expression of SPATA2 in adult mouse testis were significantly higher than that of other organs and puberty testes. Proof of immunohistochemistry, SPATA2 protein was localized in the seminiferous tubules in the Sertoli cell cytoplasm.2. by CRISPR/Cas9 gene editing technology, using Cas9n nuclease Cas9 mutant of the SPATA2 gene mutation, F0 mutation generation, through analysis and screening out the optimal mutation lines. Hybridization for two generations of homozygous individuals, through RT-PCR, Western blot and immunofluorescence verified testis gene knockout efficiency, for the study of.3. further the analysis of the SPATA2 index in addition to knock on male reproductive function in mice, found that knockout mice testicular size, weight compared with the wild type nest was reduced by 1/3, 4 The month old mice testis seminiferous tubule diameter smaller, seminiferous epithelium thinning phenomenon. Further analysis found that knockout sperm epididymal mouse decreased appeared some morphological abnormalities in 40%. and sperm, sperm motility decreased.4. mating experiment, compared with the control littermates SPATA2, knock out the litter size of male rats was decreased 2.36, the difference was significant. Then the fertilization experiment in vivo, and proved that the knockout of superovulation in female rats mated with male rats, the oocyte fertilization rate showed significantly decreased.5. immunohistofluorescence staining demonstrated that SPATA2 knockout mice testis in PCNA, the number of positive cells decreased, and the apoptotic cells did not increase. Further testing found that the PLZF marker of spermatogonial stem cell number decreased, but the difference was not significant; mark SCP3 and gamma H2A.X spermatocytes fine The number of cells was significantly decreased. The preliminary interpretation of the SPATA2 knockout mice sperm directly causes the decrease in the number of.6. in SPATA2 expression in Sertoli cells, Sertoli cells labeled with Wt1 method to detect the testicular development period and adult Sertoli cell number, the conclusion is the number of Sertoli cells did not change after using complete. The detection of the blood testis barrier biotin tracer method, found that SPATA2 knockout mice blood testis barrier damage, which further reveals the proliferation of germ cells in testis decreased,.7. causes decrease in the number of Sertoli cells expressed genes were detected and found that inhibin A subunit knockout increased expression of mouse testis, suggesting that this may be the reason for a variety of phenotypes. At the same time, to detect the pituitary follicle stimulating hormone beta subunit FSH expression decreased. In summary, this paper proved in mice The support of cytoplasmic SPATA2 expression in testis, and the use of CRISPR technology to establish the SPATA2 knockout mice, revealed that SPATA2 knockout leads to increased expression of negative control factor in the testis - inhibin FSH, so that the expression of FSH decreased and impaired male reproductive system, reduced sperm count, reproductive capacity decreased.

【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q492.4

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3 ;六、曲細(xì)精管的支持細(xì)胞和血睪屏障[J];遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報;1978年02期

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10 胡承閱;配子細(xì)胞對支持細(xì)胞的黏附及細(xì)胞間相互作用[J];國外醫(yī)學(xué)(計劃生育分冊);2003年02期

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10 米美玲;鄒挺;楊蓓;熊明娣;王晶磊;徐斯凡;;睪丸支持細(xì)胞與大鼠海馬細(xì)胞培養(yǎng)作用的初步研究[A];Proceedings of the 7th Biennial Meeting and the 5th Congress of the Chinese Society for Neuroscience[C];2007年

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5 記者 劉澤林;“準(zhǔn)精子”在猴類體外培育成功[N];健康報;2013年

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7 河北農(nóng)大動科院 王立澤 王建濤 張國賓;給狐采精勿棄精清[N];河北科技報;2007年

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9 汪文;做個準(zhǔn)爸爸，你準(zhǔn)備好了嗎？[N];江蘇科技報;2000年

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