本文關(guān)鍵詞： 非勻稱性身材矮小 骨骼畸形 臨床表型 基因型　出處：《山東大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景隨著國民經(jīng)濟增長和物質(zhì)生活水平的提高,兒童身高問題越來越受到關(guān)注,身材矮小也逐漸引起人們重視。身材矮小若未得到及時準確的診斷并盡早干預,將給個人、家庭乃至全社會帶來沉重的精神和經(jīng)濟負擔。矮小癥(Short stature,SS)是兒科常見病,是指生活在相似環(huán)境下的同性別、同年齡和同種族的個體身高低于正常人群平均身高2個標準差者,或低于第三百分位數(shù)者。SS根據(jù)患兒體型的勻稱程度可分為勻稱性身材矮小和非勻稱性身材矮小兩種類型。值得注意的是,非勻稱性身材矮小常合并有骨骼畸形(Skeletal dysplasia,SD)。據(jù)統(tǒng)計,SD的總體出生發(fā)病率為1/5000,這占了所有患有出生缺陷兒童的5%。然而,由于診斷條件所限、漏診誤診等原因,SD的真實發(fā)病率可能更高。此外,SD患兒除通常表現(xiàn)的肌肉骨骼系統(tǒng)的異常外還常同時合并多系統(tǒng)功能的異常,包括聽力、視力、神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、心臟、腎臟和心理等方面,導致患兒嚴重的身體殘疾,日常生活無法自理甚或早年夭折。由于SD典型的遺傳異質(zhì)性,早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早干預可能是減少其傷害最有效的方法之一。然而,SD包含數(shù)百種遺傳和臨床表現(xiàn)高度異質(zhì)性的疾病,這給疾病的精準診斷和治療帶來了巨大的挑戰(zhàn)。依照《國際遺傳性骨病分類標準2015年版》,遺傳性骨病(Genetic skeletal disorders,GSD)的總數(shù)達436種,并根據(jù)其分子遺傳、生化及影像學的特點分為42組;與疾病相關(guān)的基因數(shù)也從2010年報告的226個增至364個。常見的GSD有:股骨頭缺血性壞死(Avascular necrosis of the femoral head, ANFH)、軟骨發(fā)育不全(Achondroplasia, ACH)、脊柱骨骺發(fā)育不良(Spondyloepiphyseal dysplasia, SED)、多發(fā)性骨骺發(fā)育不良(Multiple epiphyseal dysplasia,MED)、成骨不全(Osteogenesis imperfect, OI)等等。在過去的十年里,對眾多GSD相關(guān)分子機制方面的研究已經(jīng)取得了顯著性的進展。然而,有關(guān)臨床表型與基因型之間的關(guān)系仍知之甚少。因此,完善的臨床資料——逐步深入的診斷——揭示分子致病機制,不僅能為臨床醫(yī)生提供鑒別診斷思路,還將為科研工作者更深入地研究基因功能提供線索。然而,迄今為止,對此類表現(xiàn)為非勻稱性身材矮小伴SD的GSD的類似研究仍非常罕見。研究目的1.對納入本研究的7個典型的非勻稱性身材矮小伴SD家系的臨床資料進行總結(jié)分析。2.對所有納入本研究的患者進行相關(guān)致病基因的篩查,明確致病基因及相應的突變位點及類型。3.選取新發(fā)的突變,對其進行相關(guān)的生物信息學分析,預測其對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變的影響。4.探討非勻稱性身材矮小伴SD臨床表型與基因型的相關(guān)性。5.為廣大臨床醫(yī)生提供系統(tǒng)的非勻稱性身材矮小伴SD的臨床診斷思路。研究對象和方法1.研究對象:山東省立醫(yī)院小兒內(nèi)分泌科自2015年9月至2016年10月收集的7個典型的非勻稱性身材矮小伴SD的家系。2.研究方法:(1)對7個典型家系先證者的遺傳方式、臨床表現(xiàn)及影像學特點進行分析;(2)對7個典型家系先證者及其家系中有類似表現(xiàn)的親屬進行基因突變檢測,應用目標外顯子捕獲測序(Targeted exome sequencing, TES)技術(shù)(覆蓋495個矮身材相關(guān)的候選基因)進行PCR擴增并測序。(3)選取新發(fā)的突變,對其進行相關(guān)的生物信息學分析,預測其對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變的影響。(4)總結(jié)患兒臨床表現(xiàn)、影像學特點及相關(guān)基因突變結(jié)果,明確診斷,并分析探討非勻稱性身材矮小伴SD臨床表型與基因型的相關(guān)性。(5)通過文獻復習,提供系統(tǒng)的非勻稱性身材矮小伴SD的臨床診斷思路。研究結(jié)果1.臨床特點分析.:本研究中7個典型家系的先證者均表現(xiàn)為非勻稱性身材矮小伴SD,例如:頸短(P1,P2, P4, P5),雞胸(Pl,P4, P5, P6, P7),桶狀胸(P2),駝背和脊柱側(cè)凸(P4),指間關(guān)節(jié)腫脹(P3)和“三叉”手(P6)。7個先證者包括3個男性和4個女性,平均年齡為8.1歲(2歲3月-12歲)。3個患兒(P1,P6,P7)出生時起病,3個患兒(P3,P4,P5)兒童早期起病,1個患兒(P2)兒童晚期起病。所有患兒的身高均低于同性別和同年齡正常人群平均身高2個標準差,根據(jù)上部量/下部量比率(Upper-to-lower body-segment ratio, U/L)和指間距,5個患兒(P1-P5)診斷為短軀干型身材矮小,2個聲兒(P6,P7)診斷為短肢型身材矮小。其他臨床表型的嚴重程度和受累的家庭成員也各有不同�？傊�,根據(jù)體格檢查和各參數(shù)測量的指標,7個先證者均符合非勻稱性身材矮小伴SD的診斷。2.生化指標分析:7個先證者均進行常規(guī)生化指標的檢測。堿性磷酸酶(Alkalinephosphatase,ALP)因與兒童的生長發(fā)育相關(guān),水平明顯增高,其余生化檢測指標均在正常范圍。隨后進行骨代謝指標的檢測,25-羥維生素D ( 25-hydroxy vitamin D, 25(OH)D )水平顯著減少,而甲狀旁腺素(Parathyroid hormone, PTH)水平在正常范圍。7個先證者起初亦被懷疑患有風濕結(jié)締組織性疾病,然而,所有炎癥和類風濕因子均在正常范圍。所有實驗室檢查結(jié)果均不支持結(jié)締組織性疾病的診斷。3.影像學結(jié)果:7個先證者的影像學結(jié)果均顯示脊柱、骨盆和四肢的畸形,但每個患兒各有特點。7個先證者主要的影像學特征表現(xiàn)如下:椎體扁平、骨骺發(fā)育不良和干骺端的改變(P1);椎體扁平、椎體后緣呈“駝峰狀”改變(P2);“子彈頭”樣的椎體、指間關(guān)節(jié)腫脹伴關(guān)節(jié)間隙狹窄(P3);脊柱側(cè)彎、椎體扁平呈“子彈頭”樣的外觀、股骨頭和髖臼發(fā)育不良(P4);椎體扁平、椎間隙狹窄、長骨干骺端顯著性增寬、雙手短管狀骨呈“啞鈴狀”(P5); L1-L5椎弓根間距逐漸變窄(P6);四肢長骨短及干骺端增寬(P7)。4.基因突變的檢測:為進一步明確診斷,我們隨后應用TES技術(shù)對7個先證者和他們的家庭成員進行了基因突變檢測。我們分別在COL2A1、SEDL、WISP3、GALNS、TRPV4和FGFR3六個不同的基因上發(fā)現(xiàn)了突變,分別為P1在COL2A1基因上的雜合突變c.1636GA (G546S),P2在SEDL基因上的缺失突變1661-bp (in5/ex6del), P3在PWISP3基因上的復合雜合突變c.730GC (G244R) /c.589+2TC (splicing),P4 在 GALNS基因上的復合雜合突變 c.516_ 518delCAA (p.172delN) /c.719AG (Y240C),P5 在TRPV4基因上的雜合突變c.2395CG (P799A),P6、P7分別在FGFR3基因上的雜合突變 c.1138GA (G380R)、c.1284CA (p.N428K)。我們通過進一步檢索人類基因組突變數(shù)據(jù)庫(Human Gene Mutation Database, HGMD),發(fā)現(xiàn)了 3個新的致病性突變,包括:SEDL基因上的缺失突變1661-bp (in5/ex 6del),WISP3基因上的錯義突變c.730GC (G244R)和GALNS基因上的缺失突變c.516_518delCAA (p.172delN),其余均為先前報道過的已知突變。5.生物信息學分析:為了證明本研究中3個新發(fā)突變的致病性,我們進行了生物信息學分析。人類SEDL基因包含6個外顯子,跨度約20 kb的基因組DNA,編碼140個氨基酸。423 bp的編碼區(qū)包含外顯子3 -6,而非編碼區(qū)由外顯子1、外顯子2、外顯子3的5'端和外顯子6的3'端構(gòu)成。起始密碼子(ATG)位于外顯子3,而終止密碼子(TGA)位于外顯子6。1661-bp的缺失包含806 bp在內(nèi)含子5,99 bp在外顯子6和756 bp在外顯子6的3'端。人類SEDL基因的結(jié)構(gòu)域包含Sedlin和N端保守性的區(qū)域(Sedlin_N;氨基酸9-136)。P2大片段的缺失包含外顯子6的剪切位點,勢必會造成轉(zhuǎn)錄和翻譯的異常,進而導致蛋白結(jié)構(gòu)不完整或整個缺失,因此突變的SEDL基因的蛋白功能也將受到影響。人類WISP3基因包含5個外顯子,跨度約15 kb的基因組DNA,編碼372個氨基酸。1119bp的編碼區(qū)包含外顯子1-5,而非編碼區(qū)由外顯子1的3'端和外顯子5的5'端構(gòu)成。起始密碼子(ATG)位于外顯子1,而終止密碼子(TAA)位于外顯子5。人類WISP3基因的結(jié)構(gòu)域包含胰島素樣生長因子結(jié)合模塊(Insulin-like growth factor binding-like module, IGFBP;氨基酸46-116)、血管性血友病 C 型重復模塊(Von Willebrand type C repeat module,VWC;氨基酸117-180)、血小板反應蛋白1型重復模塊(Thrombospondin type 1 repeat module, TSP-1;氨基酸207-261 )和C末端半胱氨酸結(jié)(C-terminal cysteine knot, CTCK;氨基酸 262-354)。PolyPhen-2 軟件分析顯示新錯義突變c.730GC (p.G244R)得分為1.00,提示W(wǎng)ISP3基因的突變可能引起蛋白功能受到損害。通過氨基酸序列比對分析顯示,第244位氨基酸在多個不同物種上是高度保守的。新發(fā)突變WISP3位于TSP-1結(jié)構(gòu)域,結(jié)合肝素或硫酸化蛋白聚糖調(diào)節(jié)細胞粘附和維持細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)成分,因此可能導致異常蛋白質(zhì)聚集在細胞質(zhì)中。人類GALNS基因有14個外顯子,跨度約50 kb的基因組DNA,編碼522個氨基酸。人類GALNS結(jié)構(gòu)域包含N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸鹽硫酸酯酶(N-acetylgalactosamine-6-sulphatase, GALNS;氨基酸 30-494)。通過氨基酸序列比對分析顯示,第172位和240位氨基酸在多個不同物種上均是高度保守的。突變的GALNS可能破壞蛋白質(zhì)的疏水核心區(qū),導致錯誤折疊并影響其催化活性。6.明確診斷:綜上所述,基于臨床數(shù)據(jù)、影像學特征和基因檢測結(jié)果,得出本研究中7個先證者的明確診斷。Pl診斷為先天性脊柱骨骺發(fā)育不良(Spondyloepiphyseal dysplasia congenital, SEDC),P2 診斷為 X 連鎖遲發(fā)性脊柱骨骺發(fā)育不良(X-linked spondyloepiphyseal dysplasia tarda,SEDT),P3診斷為晚發(fā)型脊柱骨骺發(fā)育不良伴進行性骨關(guān)節(jié)病(Spondyloepiphyseal dysplasia tarda with progressive arthropathy, SEDT-PA),P4 診斷為粘多糖病IVA 型(Mucopolysaccharidosis type IVA, MPS IVA) , P5 診斷為間向性骨發(fā)育不良(Metatropic dysplasia, MD),P6診斷為ACH, P7診斷為軟骨發(fā)育低下(Hypochondroplasia,HCH)。研究結(jié)論1.非勻稱性身材矮小伴SD的臨床表型與基因型具有相關(guān)性;2. TES技術(shù)對非勻稱性身材矮小伴SD患兒的病因診斷具有重要價值;3.本研究發(fā)現(xiàn)3個新的致病性基因突變,為其功能性研究提供線索;4.建立系統(tǒng)的非勻稱性身材矮小伴SD的臨床診斷流程。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R725.8;R726.8

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5 本版編輯邋陸文麗 白馨芝 施e，

本文編號：1547620