本文關(guān)鍵詞： 肺癌 miR-130a 靶基因GOLPH3 細(xì)胞增殖 凋亡　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景迄今為止,肺癌占據(jù)著世界范圍內(nèi)包括中國(guó)的腫瘤發(fā)病第一位[1]。肺癌按病理分類分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌,其中非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占全部肺癌的85%左右。近十年來(lái),肺癌的診斷以及治療有了劃時(shí)代的發(fā)展,除了經(jīng)典的三大治療如手術(shù)、放療、化療,從EGFR、ALK基因重排等等方面肺癌的治療進(jìn)入了新的靶向時(shí)代,吉非替尼、厄洛替尼、�？颂婺�、克唑替尼、邁瑞替尼(AZD9291)等等藥物的發(fā)展使得肺癌的生存率已經(jīng)有了很大的提高,然而對(duì)于中晚期肺癌來(lái)說(shuō),5年的生存率仍不容樂(lè)觀犯]。目前診斷為Ⅲb或IV期的肺癌患者,最主要的治療手段仍然是放化療,當(dāng)然新的分子靶向治療也已經(jīng)進(jìn)入一線治療。然而化療的效果仍然是差強(qiáng)人意,肺癌晚期患者無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間(PFS)僅為3-5個(gè)月,OS大約在8-10個(gè)月左右船]。目前腫瘤的醫(yī)療已進(jìn)入精準(zhǔn)治療的時(shí)代,有明確驅(qū)動(dòng)基因檢測(cè),并接受相應(yīng)的分子靶向治療使得肺癌晚期患者的緩解率高達(dá)72%左右,肺癌患者患者5年的生存率希望大幅度提高,但是目前也有研究證實(shí),肺癌EGFR-TKI的治療往往在治療11月左右時(shí)候出現(xiàn)耐藥Ⅲ,因此為改善肺癌患者的生存時(shí)間和生活質(zhì)量,在基因蛋白組學(xué)、表觀遺傳學(xué)開(kāi)展的如火如荼的時(shí)候,從基因角度去尋找潛在的肺癌發(fā)病機(jī)制和合適的治療靶點(diǎn)對(duì)于肺癌的診治具有至關(guān)重要的意義。目前有大量關(guān)于miRNAs的研究,提示miRNAs是一種新型腫瘤標(biāo)記物可能。miRNAs也有癌基因和抑癌基因功能,目前認(rèn)為miRNAs和腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系,因此深入研究miRNAs和肺癌發(fā)病機(jī)制的關(guān)系,有可能為肺癌的診治提供新靶點(diǎn)。miR-130a是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)miRNA分子,研究發(fā)現(xiàn),miR-130a能夠影響MAPK、AR信號(hào)通路活性,抑制前列腺癌的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移,發(fā)揮著抑癌基因的功能㈨。更多的研究顯示,miR-130a也能夠抑制乳腺癌、肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移睛]。目前,miR-130a在肺癌中的表達(dá)及作用尚不明確。本研究擬通過(guò)免疫印跡法、定量PCR法、Transwell法及熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)等技術(shù)來(lái)研究miR-130a在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。目的：通過(guò)基因芯片篩選出肺癌細(xì)胞及對(duì)照組上差異表達(dá)的miRNA分子,選出miR-130a后檢測(cè)其在人肺癌組織中的表達(dá)并分析其與肺癌臨床病理特征之間的關(guān)系；并研究miR-130a在肺癌中的生物學(xué)功能和發(fā)病機(jī)制。方法：1、本實(shí)驗(yàn)選用Affymetrix芯片檢測(cè)2種肺癌細(xì)胞系(A459和Calu-3)及對(duì)照的正常支氣管上皮細(xì)胞中的miRNAs表達(dá)情況。驗(yàn)證芯片數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠后挑選miR-130a作為研究對(duì)象。2、采用實(shí)時(shí)定量PCR (qRT-PCR法)檢測(cè)miR-130a在人肺癌組織中的表達(dá),采用脂質(zhì)體法將miR-130a mimic轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞株A549和Calu-3,通過(guò)CCK-8試驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)、Transwell實(shí)驗(yàn)等方法觀察miR-130a對(duì)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、侵襲等影響。3、預(yù)測(cè)、驗(yàn)證miR-130a相應(yīng)的靶基因,進(jìn)一步研究其和肺癌的發(fā)病機(jī)制關(guān)系：利用公認(rèn)的target靶基因預(yù)測(cè)軟件,篩選出GOLPH3基因可能為miR-130a的下游靶基因。然后在肺癌細(xì)胞系中利用qRT-PCR法和western blotting檢測(cè)過(guò)表達(dá)和抑制miR-130a對(duì)GOLPH3基因mRNA的影響以及相應(yīng)的蛋白水平的改變。熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-130a對(duì)GOLPH3的反饋調(diào)控作用,進(jìn)一步探索miR-130a在肺癌發(fā)病上的調(diào)控機(jī)制。結(jié)果：1、Affymetrix芯片檢測(cè)顯示,和正常肺上皮細(xì)胞系(HBE)相比,肺癌細(xì)胞系(A459和Calu-3)中表達(dá)上調(diào)的miRNA有24個(gè)(fold change2),如hsa-miR-25、 hsa-miR-222、hsa-miR-30e、hsa-miR-320e、hsa-miR-22、hsa-miR-16等,表達(dá)下調(diào)的有19個(gè)(fold change0.5),如hsa-miR-9、hsa-miR-130a、hsa-miR-21、 hsa-miR-205等。查閱了有關(guān)的文獻(xiàn),我們認(rèn)為miR-130a在多種腫瘤如胃癌、肝癌等中表達(dá)異常,提示我們miR-130a可能與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡有關(guān),但是其在肺癌中的表達(dá)變化及其功能研究方面報(bào)道甚少。最終我們選擇miR-130a作為下一步的研究對(duì)象。為使得研究結(jié)果可靠,我們采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR法驗(yàn)證miR-130a在肺癌組織和細(xì)胞中的表達(dá),結(jié)果提示在肺癌組織和肺癌細(xì)胞中miR-130a表達(dá)較對(duì)照組均顯著下調(diào),與芯片結(jié)果吻合。提示miR-130a和肺癌的發(fā)病機(jī)制有密切關(guān)系。2、在不同組織類型比較中,小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌間miR-130a表達(dá)水平無(wú)明顯差距(data not shown) (P0.05);非小細(xì)胞眭鱗癌組織miR-130a;菱達(dá)(0.68±0.13)低于肺腺癌(P0.05)；此外,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(NI)患者的miR-130a表達(dá)(0.41±0.06)明顯低于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組(NO)(P0.05),且隨著肺癌臨床分期的升高,Ⅲ/Ⅳ期患者組織中表達(dá)(0.52±0.14)出現(xiàn)明顯低于Ⅰ/Ⅱ(P0.05)；體外實(shí)驗(yàn)中,miR-130a轉(zhuǎn)染后,CK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-130a mimic：組較正常對(duì)照組miR130a mimi及能抑制肺癌細(xì)胞的增殖；EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,轉(zhuǎn)染組的肺癌細(xì)胞增殖能力明顯下降；小室則提示轉(zhuǎn)染組較對(duì)照組對(duì)肺癌細(xì)胞的遷移與侵襲能力有明顯影響；平Transwell板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,轉(zhuǎn)染組細(xì)胞較對(duì)照組克隆形成能力減弱；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,的肺癌細(xì)胞克隆形成率遠(yuǎn)低于對(duì)照組細(xì)miR-130a胞,另外轉(zhuǎn)染組的肺癌細(xì)胞出現(xiàn)了G1/S期阻滯,表明表達(dá)升高后通過(guò)調(diào)控miR-130aG1/S期轉(zhuǎn)換來(lái)抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染組的裸鼠成瘤能力較對(duì)照組顯著減弱。3.從生物信息軟件中,我們預(yù)測(cè)可能是GOLPH3作用的靶基因之一。miR-130a檢測(cè)了western blotting蛋白在肺癌組織、肺癌細(xì)胞以及對(duì)照組中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)GOLPH3其在肺癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織。進(jìn)一步采用驗(yàn)證qRT-PCR蛋白和GOLPH3值,成功構(gòu)建mRNA質(zhì)粒后,在pGL3-GOLPH3-Mut野生型重組質(zhì)粒中,轉(zhuǎn)染GOLPH3組的熒光強(qiáng)度比值(0.61±0.11)較轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照(1.27±0.05)明顯降低,mimicsp0.01；在突變型重組質(zhì)粒中,轉(zhuǎn)染組的熒光強(qiáng)度比值(1.33±0.06)對(duì)比轉(zhuǎn)GOLPH3染陰性對(duì)照(1.30±0.05)兩者比較無(wú)明顯差異,pO.05；表明是通過(guò)結(jié)miR-130a厶口GOLPH3的3'-UTR對(duì)GOLPH3進(jìn)行調(diào)控,另外發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-130a后GOLPH3的蛋白表達(dá)明顯抑制,但mRNA的表達(dá)變化不大,提示miR-130a可以抑制含有其結(jié)合位點(diǎn)的報(bào)告基因的活性,而對(duì)突變質(zhì)粒沒(méi)有影響。說(shuō)明生物信息學(xué)軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果是準(zhǔn)確可靠的。進(jìn)一步westernblotting發(fā)現(xiàn)miR-130a過(guò)表達(dá)后,靶基因GOLPH3下游周期蛋白Cyclin E1、CyclinD1、GAPDH表達(dá)均出現(xiàn)了明顯下降,提示miR-130a的表達(dá)與GOLPH3表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。另外轉(zhuǎn)染miR-130a mimics與pGL3-GOLPH3-Mut 3'-UTR后,與僅過(guò)表達(dá)miR-130a組肺癌細(xì)胞相比,GOLPH3和WIS、β-catenin表達(dá)升高,提示miR-130a可能是通過(guò)WNT/WIS通路影響肺癌的發(fā)生發(fā)展。結(jié)論：1.從芯片檢測(cè)和RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看,證實(shí)了miR-130a在肺癌組織/細(xì)胞中的表達(dá)較對(duì)照組顯著降低,提示miR-130a和肺癌的發(fā)生發(fā)展有一定的相關(guān)性。2. miR-130a表達(dá)增加能抑制肺癌細(xì)胞體內(nèi)外的增殖能力、遷移與侵襲能力,促使肺癌細(xì)胞凋亡,提示在肺癌增殖、侵襲和凋亡中miR-130a艮可能起重要作用。3. miR-130a和靶基因GOLPH3呈負(fù)相關(guān),miR-130a可能是通過(guò)WNT/WIS通路影響肺癌的發(fā)生發(fā)展,進(jìn)一步深入研究miR-130a則其有望成為肺癌基因治療的新靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R734.2

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本文編號(hào)：1547548